Analysis of Cell-cell interaction models with CRISPR library

利用 CRISPR 文库分析细胞间相互作用模型

基本信息

批准号：
21K06945
负责人：
倉田盛人
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06945/
关键词：
薬剤耐性 CRISPR screening 細胞間相互作用

项目摘要

腫瘍微小環境において、がん幹細胞と間質支持細胞の相互作用により薬剤耐性が誘導されることが知られている。我々は新たな実験系である「間接的CRISPR screening」を確立した。昨年までに、間接的CRISPR screeningにて得られた各候補遺伝子の変異支持細胞を作成し、それらと共培養した白血病細胞株や膵癌細胞株において抗癌剤曝露下で有意に生存・増殖することが確認された。C9orf89、MAGI2、MLPH、RHBDD2の4種のHEK293T 欠損細胞クローンに関して、RNA-sequencingを行った。GSEA解析では、いずれの欠損細胞においてもサイトカイン活性が最も活性化されており、その中でも特にCXCL12の発現が共通して最も上昇していた。定量的PCRおよびELISAの結果よりRHBDD2欠損でのCXCL12発現・分泌上昇が確認された。また、CXCL12中和抗体を用いた共培養・Ara-C曝露実験を行ったところ、HEK293T/UE7T-9 RHBDD2欠損細胞株によるAra-C曝露下でのU937のアポトーシスの抑制が、中和抗体によりキャンセルされた。間質細胞の分泌するCXCL12による腫瘍細胞の薬剤耐性獲得機構として、PI3K-Akt-mTOR経路の活性化が知られている。HEK293T/UE7T-9 RHBDD2欠損細胞とU937を共培養し、Aktのリン酸化を評価した。U937におけるAktのリン酸化は、コントロール共培養群あるいはU937単独培養群と比較して、HEK293T RHBDD2欠損細胞と共培養した際に有意に亢進していた。また、膵癌臨床検体の検討では、間質細胞でのRHBDD2低発現が独立予後不良因子であり、またRHBDD2とCXCX12発現に逆相関することが確認された。

众所周知，癌症干细胞与基质支持细胞之间的相互作用在肿瘤微环境中诱导耐药性。我们已经建立了一个新的实验系统“间接CRISPR筛选”。直到去年，创建了通过间接CRISPR筛选获得的每个候选基因的突变支持细胞，并证实它们可以在白血病和胰腺癌细胞系中显着生存和增殖，并在抗癌药物暴露下与这些细胞共培养。在四个HEK293T缺陷型细胞克隆上进行RNA测序：C9ORF89，MAGI2，MLPH和RHBDD2。在GSEA分析中，细胞因子活性在所有缺陷的细胞中最激活，其中CXCL12表达特别普遍，最高。定量PCR和ELISA证实了RHBDD2缺乏症中CXCL12表达和分泌的增加。此外，当使用CXCL12中和抗体进行共培养和ARA-C暴露实验时，HEK293T/UE7T-9 RHBDD2缺乏细胞系在ARA-C暴露下对U937凋亡的抑制作用被中和抗体取消。 PI3K-AKT-MTOR途径的激活被称为通过基质细胞分泌的CXCL12在肿瘤细胞中获取耐药性的一种机制。 HEK293T/UE7T-9 RHBDD2缺陷细胞和U937共同培养以评估Akt的磷酸化。与对照共培养组或单独的U937组相比，与HEK293T RHBDD2缺陷型细胞共培养时，U937中AKT的磷酸化显着增加。此外，在胰腺癌的临床标本中，可以证实，基质细胞中Rhbdd2的低表达是独立的较差的预后因素，并且与Rhbdd2和Cxcxcx12的表达成反比。