Construction of Multiple Sample Analysis System Using FRET System and Search for Inhibitors of Virus Polymerization Proteins

利用FRET系统构建多样品分析系统并寻找病毒聚合蛋白抑制剂

• 批准号: 21K06872
• 负责人: 上 大介
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kyoto Prefectural University of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06872/
• 关键词: FRET; 阻害剤; 多検体解析; ウイルス由来重合タンパク質

RNAウイルスSARS-CoV-2は世界中で大流行し、治療薬の開発競争が激化している。治療薬のターゲット分子はウイルスの表面抗原やRNAポリメラーゼが多く、細胞内で増加したウイルスゲノムRNA除去を目指した治療薬開発は報告がない。このゲノムRNAはNucleocapsid protein (N protein)と結合、さらにN protein同士で重合することで、細胞内で安定化する。本研究はSARS-CoV-2のN proteinの重合を阻害する低分子化合物をハイスループットシステムにて探索し、重合阻害の有効性をvitroにて証明することを目的としている。そこで我々は重合化を評価できるFRETシステムとイメージングサイトメータを用いたシステムを設計・構築した。このシステムを用いて、重合阻害を可能にする低分子化合物を探索し、そのゲノムRNAの安定性をvitroにて解析する。これらの結果と解析システムの構築はN proteinをもつ数多くのウイルスに対する新たな治療薬の開発の先駆的な手法となりえる。今年度は前年度で問題点を解決した新しいベクター構築を行い、その評価を行ってみたが、予定の結果は得られなかった。そこでレトロウイルスを用いて安定発現株を樹立し、シングルセルクローニングを行った。取得した細胞はIn Cell Analyzer2200にて撮像し、FRETのポジティブコントロール、ネガティブコントロール株と比較した。

RNA病毒SARS-COV-2在世界范围内广受好评，开发治疗药物的竞争正在加剧。治疗药物的靶标分子在病毒表面抗原和RNA聚合酶中含量很高，并且没有关于旨在消除细胞内病毒基因组RNA增加的治疗药物发展的报道。该基因组RNA通过与核蛋白蛋白（N蛋白）结合并在N蛋白之间进行聚合通过结合在细胞内稳定。这项研究旨在寻找使用高通量系统抑制SARS-COV-2 N蛋白聚合的低分子量化合物，并证明体外聚合抑制的有效性。因此，我们使用FRET系统和可以评估聚合的成像细胞仪设计和构建了系统。使用该系统，搜索允许聚合抑制的小分子化合物，并在体外分析其基因组RNA的稳定性。这些结果和分析系统的构建可能是开发许多N蛋白病毒的新治疗剂的开创性方法。今年，我们构建了一个新的向量，该向量解决了上一年的问题并对其进行了评估，但我们无法获得计划的结果。因此，使用逆转录病毒建立了稳定的表达应变，并进行了单细胞克隆。将所获得的细胞与细胞Analyzer2200成像，并与FRET的阳性和阴性对照菌株进行比较。