Establishing the type I CRISPR platform for extra chromosome elimination through epigenetic modulation

建立通过表观遗传调控消除额外染色体的 I 型 CRISPR 平台

基本信息

批准号：
21K06835
负责人：
橋詰令太郎
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Mie University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06835/
关键词：
染色体消去 CRISPR/Cas トリソミー Down症候群 iPS細胞染色体 CRISPR

项目摘要

本課題は、Down症候群などの過剰染色体を有する核型に対し、染色体消去技術の新規開発を試みるものである。我々研究グループは、トリソミー21のiPS細胞を用いたin vitro実験系において、CRISPR/Cas9による21番染色体単一アレルに対する染色体切断が、標的染色体の細胞からの排除を誘導する知見を得た。さらに、切断箇所数と染色体除去率には正の相関があること、非相同末端結合によるDNA切断後修復機構に関与するLIG4遺伝子や、MMEJに与るPOLQの遺伝子ノックダウンが、染色体除去率の上昇に貢献することを見出した。これらは、CRISPR/Cas9等で染色体切断する際、修復不可能となる確率が上昇し、結果、染色体除去率が向上しているものと思われた。細胞周期依存性であるのか否かは、標的とする細胞によっては重要な問題となりうる。しかしながらいずれにせよ、これらCas9による物理的な染色体切断は、予期せぬ染色体の構造変異を含むゲノム改変のリスクを内包している。そこで我々は、単一染色体アレル特異的な方法で、II型CEISPR-CasシステムであるCas9とともにI型CRISPRであるCas3システム等を用いた、ゲノム改変を極力抑えたあるいは行わない方法の開発を目指している。II型CRISPR のCas9が1ヶ所のDNA切断を行うのに対し、I型CRISPRであるCas3は、リール状にDNAをたぐり寄せるかたちでDNA上を移動しつつ、シュレッダーのように約100 kbに及ぶ長鎖DNAを一方向性に分解することを特徴としている。本研究では、CRISPR/Cas9で得られている知見・理解を基盤とし、ゲノム改変リスクを最少化する目的でペリセントロメア領域に対する染色体分解や、標的染色体へのエピゲノム修飾によるゲノム改変フリーの染色体消去をCRISPR/Cas3を含めて試みる。

该项目试图针对唐氏综合症等具有额外染色体的核型开发一种新的染色体缺失技术。在使用具有 21 三体性的 iPS 细胞的体外实验系统中，我们的研究小组发现 CRISPR/Cas9 对 21 号染色体的单个等位基因的染色体切割诱导了细胞中目标染色体的消除。此外，断裂位点的数量与染色体去除率、LIG4基因的基因敲低（通过非同源末端连接参与DNA断裂后修复机制）和POLQ（参与MMEJ，降低了染色体去除率，发现这有助于增加。这些似乎增加了使用CRISPR/Cas9等切割染色体时染色体无法修复的概率，从而提高了染色体去除率。取决于靶细胞，它是否依赖于细胞周期可能是一个重要问题。然而，无论如何，Cas9 造成的这些物理染色体断裂都会带来基因组修饰的风险，包括意外的染色体结构突变。因此，我们的目标是开发一种使用单染色体等位基因特异性方法最小化或不涉及基因组修饰的方法，该方法使用 Cas9（II 型 CEISPR-Cas 系统）和 Cas3 系统（I 型 CRISPR）。 Cas9 是一种 II 型 CRISPR，在一个位置切割 DNA，而 Cas3 是一种 I 型 CRISPR，以卷轴状方式在 DNA 上移动，像粉碎机一样延伸超过约 100 kb，其特点是能够单向降解长片段。 -DNA链。在本研究中，基于CRISPR/Cas9获得的知识和理解，我们的目标是通过着丝粒周围区域的染色体降解和目标染色体的表观基因组修饰来进行无基因组修饰的染色体删除，以最大程度地降低基因组风险尝试加入 CRISPR/Cas3。