ガングリオシドのアシル鎖構造を介した自然免疫制御メカニズムの解明

阐明神经节苷脂酰基链结构介导的先天免疫控制机制

基本信息

批准号：
21K06530
负责人：
狩野裕考
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tohoku Medical and Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は、以下の研究成果を得ることができた。(1) 組み換え全長Casp4/11発現系の構築：これまでに、マクロファージ細胞に対するLPSおよび各種脂肪酸構造のガングリオシドGM3の共刺激によって、炎症性サイトカインIL-1aの産生量が大幅に増大または抑制されることを見出している。IL-1aは非古典的インフラマソームを介したパイロトーシスによって放出されることから、その構成因子であるCasp4/11（細胞内LPS受容体）が、各種脂肪酸構造のGM3分子種によって直接的に活性化制御を受ける可能性が考えられる。そこで、大腸菌発現系を用い、Casp4/11のHis-tag融合タンパク質発現系を構築した。リガンド認識後の自己切断活性を低減したCasp4(C258A)およびCasp11(C254A)変異体として発現させることで、リガンド結合によって誘導される多量体形成を観察可能なコンストラクトとした。宿主は、LPS合成経路欠損型の大腸菌発現系を用いることで、発現宿主内における意図しない多量体形成および活性化を低減できるよう考慮した。(2) 組み換え全長Casp4/11精製系および多量体アッセイ系の確立：LPS合成経路欠損型の大腸菌発現系であっても、LPS生合成中間体であるLipid-IVaは産生されることから、Affinity精製中に既報に基づいた界面活性剤による内因性代謝物洗浄ステップと、さらに界面活性剤自体の除去ステップを組み込むことで、より高純度の精製を可能にした。Affinity精製およびゲル濾過担体によるバッファー交換後のCaspase-4/11はSDS-PAGEにおいてほぼ単一バンドであり、ケミカルクロスリンクによる多量体検出アッセイにおいも単量体として得られていることが確認できた。これを用いることで、各種のスフィンゴ糖脂質分子種による多量体形成アッセイを確立した。

今年，获得了以下研究结果。（1）总长度CASP4/11构建系统：迄今为止，LPS和神经节GM3与巨噬细胞上各种脂肪酸结构的共同刺激已显着增加或抑制。由于Pyro Toxis通过非经典式室内释放IL-1A，因此构型因子CASP4/11（细胞内LPS受体）直接通过各种脂肪酸结构的GM3分子直接。可以进行。因此，使用结肠癌表达系统构建了CASP4/11 HIS-TAG融合蛋白表达系统。通过以CASP4（C258A）和CASP11（C254A）突变体表示，它们减少了配体识别后的自切除活性，可以观察到的构建体是可以观察到的构建体。考虑使用LPS合成路线缺乏结直肠直肠直径，认为宿主被认为可以减少裸露主机内的故意多重形成和激活。（2）重组总长度CASP4/11建立了精制系统和多量化测定系统：即使在LPS合成的结直肠癌中，脂质-IVA（是LPS脂质-IVA）也会产生，因此产生了亲和力，因此也会产生亲和力。亲和力提炼后的caspase-4/11和凝胶过滤载体更换缓冲液在SDS-PAGE中几乎是一个频带，并且可以证实，与化学交叉链接的多个身体检查测定的气味也可以得到ta。通过使用此功能，已经建立了一个大型Quantitarizatizatization分析，并建立了各种糖脂质莫尔斯科普斯（Molescopes）。