1細胞内RNA分子とタンパク質分子の同時・多重空間分布解析に向けた基盤技術の開発

开发一种细胞内RNA分子和蛋白质分子同时多重空间分布分析的基础技术

• 批准号: 21K06140
• 负责人: 小口 祐伴
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06140/
• 关键词: 空間マルチオミクス; シーケンス解析; シーケンス技術開発; トランスクリプトーム解析; プロテオーム解析; マルチオミックス解析; 空間マルチオミクス; シーケンス解析; シーケンス技術開発; トランスクリプトーム解析; プロテオーム解析; マルチオミックス解析

本研究は細胞内のmRNA分子とタンパク質の位置情報を1分子空間解像度で取得する新規の空間マルチオミクス解析の基礎技術の確立を目指すものである。従来の技術では、mRNAやタンパク質分子の細胞内での位置情報を取得するために、これらの分子を蛍光標識することで検出することが一般であった。しかし、蛍光標識による検出では、同時に計測の対象とできる分子の種類数は限られ、多様な分子が関与する複雑な生命現象に迫ることは難しい。そこで本研究は、蛍光色素ではなくDNAバーコードによって対象を標識することで、観察対象の高多重化を図る。また、このDNAバーコード分子の位置情報の取得は、本研究実施者がこれまでに確立したDNAバーコード1分子空間デコーディング法を活用し、1分子空間解像度での識別の実現を目指している。昨年度までにDNAバーコード１分子空間デコーディング法を実施するシーケンスフローセル基板上に、細胞由来のcDNA分子を転写できることを確認した(ここでの転写とは細胞内形成したcDNA分子をシーケンス基板上へと移し写しとることを指す)。このとき、cDNA分子は細胞における位置情報を保持したままにシーケンス基板上へと転写されることが必要となる。しかし、昨年度の時点では、細胞外の領域へのcDNA分子の転写も顕著に見られた。この分子の拡がり(核酸漏出)を防ぐことは、本系の確立のために必須である。本年度は上記の問題解決に向け、細胞前処理工程、加えて転写されたcDNAの識別に関する検討を実施した。また、同時にタンパク質の標識をDNAバーコード抗体で行う必要があり、固定操作によってこれを阻害しないことも必要となる。実際に、固定の度合いを高める漏出を低減したが、一方でcDNA量の合成量が低下した。このようにcDNAの漏出低減と合成量にはトレードオフの関係にあり、現状もこの条件検討の途上にある。

这项研究旨在建立一种用于空间多组分分析的新基本技术，该技术在单分子空间分辨率下获取了细胞中mRNA分子和蛋白质的位置信息。在常规技术中，通常通过荧光标记检测mRNA和蛋白质分子，以获取这些分子细胞内的位置信息。但是，当使用荧光标签检测时，可以同时测量的分子数量受到限制，因此很难进入涉及各种分子的复杂生命现象。因此，这项研究旨在通过将靶标标记为DNA条形码而不是荧光染料来实现观察靶的高度多路复用。此外，该DNA条形码分子的位置信息的获取旨在通过利用研究人员建立的DNA条形码单分子空间解码方法来实现单分子空间分辨率的鉴定。据证实，可以将细胞衍生的cDNA分子转录到序列流细胞底物上，其中单个DNA条形码的单个分子进行空间解码（转录是指在序列底物上的细胞内形成的cDNA分子和复制cDNA分子）。目前，必须将cDNA分子转移到序列底物上，同时保留细胞中的位置信息。但是，截至去年，cDNA分子转录到细胞外区域也很明显。防止该分子的扩散（核酸泄漏）对于建立该系统至关重要。今年，为了解决上述问题，我们对细胞预处理过程和转录cDNA的鉴定进行了研究。还必须用DNA条形码抗体同时标记蛋白质，这不会通过固定来干扰蛋白质。实际上，增加固定程度的泄漏降低，而cDNA合成量减少。因此，cDNA泄漏的减少与合成量与当前情况正在考虑这些条件之间的权衡。