Development of muliplex, large-scale, and high-resolution genome editing technology using multi-class CRISPR system

利用多类CRISPR系统开发多重、大规模、高分辨率基因组编辑技术

基本信息

批准号：
21K06137
负责人：
佐久間哲史
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06137/
关键词：
ゲノム編集 CRISPR-Cas 遺伝子ノックイン

项目摘要

2022年度は、前年度に引き続き、マルチクラスCRISPRに用いるための各クラス・タイプのCRISPRシステムにおける技術基盤の更なる改良を進めた。クラス1システムにおいては、CRISPR-Cas3を用いた遺伝子ノックインの最適化を実施した。まず、ドナーベクターの構造として、ホモロジー配列の両外側にCRISPR-Cas3の標的配列を配し、挿入する遺伝子カセットがプラスミドベクターから切り出されるように設計することで、ノックインの効率が高まることを示した。また、Cas3とCascadeが単一のベクターから発現するように改良を加えたall-in-oneベクターの機能性を実証した。更に、様々なホモロジーアーム長でのノックインの検証を実施することで、効率的なノックインに必要となるホモロジー配列長を同定することに成功した。興味深いことに、必要なホモロジー配列長には、ゲノム上の標的配列のPAM側と逆側で差異が存在した。クラス2システムにおいては、過去に当グループが開発したゲノム編集の効率化技術であるLoADシステムを拡張し、従来使用していたMS2以外のRNAアプタマーおよびMS2コートタンパク質以外のRNA結合タンパク質のラインナップを整備した。これらを取り入れた拡張型LoADシステムの効果を検証したところ、使用するRNAアプタマーやRNA結合タンパク質によって編集結果に違いが生じることが明らかとなった。更に、先行研究においてゲノム編集パターンを変化させることが知られているT5exo-Cas9と拡張型LoAD法を組み合わせた検証を実施した結果、編集パターンの更なる変化が生じることも示された。

在2022财年，与上一年一样，我们进一步改善了在多级CRISPR中使用的每个类型CRISPR系统的技术基础。在1类系统中，使用CRISPR-CAS3进行了基因敲入优化。首先，我们证明可以通过将CRISPR-CAS3的目标序列作为供体矢量结构以及设计插入的基因盒从质粒载体中切除的插入基因盒，从而提高了敲击效率。我们还证明了通过单个矢量改进的Cas3和级联表达的多合一矢量的功能。此外，通过使用各种同源臂长度进行敲入验证，我们成功地确定了有效敲入所需的同源序列长度。有趣的是，PAM侧和目标序列的另一侧的基因组上所需的同源序列长度存在差异。在第二类系统中，我们扩展了负载系统，这是一种用于改进过去开发的基因组编辑的技术，并开发了除MS2和RNA结合蛋白以外的其他RNA适体系列，而不是我们以前使用过的MS2涂层蛋白。当我们检查纳入这些载荷系统的效果时，可以发现编辑结果的差异可能取决于RNA适体和RNA结合蛋白所使用的差异。此外，众所周知，T5EXO-CAS9的验证在先前的研究中会改变基因组编辑模式，并结合了扩展负载方法，表明编辑模式的进一步变化发生了。

项目成果

期刊论文数量（24）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

培養細胞を用いたゲノム編集研究の最前線

使用培养细胞进行基因组编辑研究的前沿

DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
井川武;鈴木誠;髙柳春希;荻野肇;佐久間哲史
通讯作者：
佐久間哲史

Updated Overview of TALEN Construction Systems

TALEN 建筑系统更新概述

DOI：
10.1007/978-1-0716-3016-7_2
发表时间：
2023
期刊：
Methods in Molecular Biology
影响因子：
0
作者：
Sakuma Tetsushi;Yamamoto Takashi
通讯作者：
Yamamoto Takashi

TALEN-Mediated Gene Editing of slc24a5 (Solute Carrier Family 24, Member 5) in Kawakawa, Euthynnus affinis

DOI：
10.3390/jmse9121378
发表时间：
2021-12
期刊：
Journal of Marine Science and Engineering
影响因子：
2.9
作者：
Dipak Pandey;T. Matsubara;Taiju Saito;Y. Kazeto;K. Gen;Tetsushi Sakuma;Takashi Yamamoto;Miyuki Mekuchi-M
通讯作者：
Dipak Pandey;T. Matsubara;Taiju Saito;Y. Kazeto;K. Gen;Tetsushi Sakuma;Takashi Yamamoto;Miyuki Mekuchi-M

Transcription activator-like effector nuclease-mediated deletion safely eliminates the major egg allergen ovomucoid in chickens

转录激活剂样效应物核酸酶介导的删除安全地消除了鸡中主要的鸡蛋过敏原卵类粘蛋白

DOI：
10.1016/j.fct.2023.113703
发表时间：
2023
期刊：
Food and Chemical Toxicology
影响因子：
4.3
作者：
Ezaki Ryo;Sakuma Tetsushi;Kodama Daisuke;Sasahara Ryou;Shiraogawa Taichi;Ichikawa Kennosuke;Matsuzaki Mei;Handa Akihiro;Yamamoto Takashi;Horiuchi Hiroyuki
通讯作者：
Horiuchi Hiroyuki

Cas9とTALEの協働によるC→TおよびA→Gの特異的で高効率な塩基編集

Cas9与TALE合作，对C→T和A→G进行特异性高效的碱基编辑