カルシウムポンプの調節メカニズムの構造学的解明

钙泵调节机制的结构阐明

基本信息

批准号：
21K06062
负责人：
椛島佳樹
金额：
$ 2.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では心筋における調節ペプチドであるphospholamban（PLN）による筋小胞体Ca2+ポンプの活性調節メカニズムの理解を目的としている。令和4年度は、前年度に引き続き、①COS細胞-アデノウイルス蛋白質発現系を用いたSERCA-PLN融合蛋白質の大量生産系の構築、②クライオ電顕を用いた原子構造決定のための試料作製条件の最適化を行うとともに、新たに、③浮遊293細胞-BacMamウイルス蛋白質発現系を用いたSERCA-PLN融合蛋白質の大量生産系の構築を行った。①前年度までに作成した20個のGly残基から成るリンカーによりSERCAとPLNを遺伝子工学的に連結した融合蛋白質の発現用コンストラクトを用いてアデノウイルスを作製した。さらに、疑似燐酸化変異を導入した融合蛋白質（S16E変異体）の発現用アデノウイルスも作製し、これらのウイルスをCOS7細胞に感染させ小スケールの発現チェックを行った。その結果、構造解析に十分な量の発現が観察されたため、ウイルスの大量調製を行い、高力価のアデノウイルスを得た。②クライオ電顕を用いた単粒子解析による構造決定を目指し、ウサギ骨格筋より精製したSERCAのナノディスク化条件を検討した。膜骨格蛋白質としてはMSP1D1を用いて界面活性剤の種類、界面活性剤の除去方法（時間、温度など）、ゲルろ過条件などを検討し、電顕観察に適したナノディスク化及び観察用グリッド作製条件を最適化することができた。③浮遊293細胞-BacMamウイルス系を用いたSERCA-PLN融合蛋白質の発現系構築を検討した。融合蛋白質の遺伝子を導入したバクミドを作製し、ウイルス調製条件を検討したところ高力価のウイルスを作製することに成功した。蛋白質発現時の培地の種類や添加剤などを検討することにより、クライオ電顕解析に適用可能な量のタンパク質を得ることができた。

这项研究旨在了解心肌中调节性肽磷酸磷酸磷酸磷酸胶质Ca2+泵活性的机制。在2022财政年度，在上一年之后，1）使用COS细胞 - 腺病毒蛋白表达系统构建了SERCA-PLN融合蛋白的质量生产系统，2）使用Croyelectron显微镜确定原子结构的优化样品制备条件，并使用Serca-Pln融合蛋白质的质量生产系统构建了浮型细胞的质量生产系统。 1）使用构建体来制备腺病毒，以表达融合蛋白的表达，这些融合蛋白涉及遗传链接SERCA和PLN的接头，该连接器由由20个gly残基组成的连接器组成，直到上一年。此外，还产生了用伪磷酸化突变引入的融合蛋白表达腺病毒（S16E突变体），并将这些病毒感染了COS7细胞并进行小规模的表达检查。结果，观察到足够的表达进行结构分析，并准备大量病毒获得高滴度腺病毒。 2）我们研究了从兔骨骼肌中纯化的SERCA纳米虫转化的条件，旨在通过使用冷冻电子显微镜通过单个颗粒分析来确定结构。作为膜骨骼蛋白，使用MSP1D1来研究表面活性剂的类型，表面活性剂去除的方法（时间，温度等），凝胶过滤条件和其他因素，并优化了纳米轴以及适用于电子显微镜观察的观察的网格的产生。 ③我们使用浮动293细胞-ACMAM病毒系统研究了SERCA-PLN融合蛋白的表达系统的构建。产生了一种Bacmid，其中引入了融合蛋白的基因，并检查了病毒制备条件，并成功产生了高滴度病毒。通过检查蛋白质表达时的培养基和添加剂的类型，我们能够获得可用于冷冻电子显微镜分析的量的蛋白质。