分離困難ウイルスの分離に向けたスパイクアダプター法の開発

开发用于分离难以分离病毒的刺突适配器方法

• 批准号: 21K05948
• 负责人: 吉永 圭介
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: National Institute of Technology, Kumamoto College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05948/
• 关键词: セルパンニング; インターナライズ; パラトープ解析; VeroE6; 発現レベルの向上; セレクション法の改良; 凸面ライブラリの構築; FIPV結合性クローン; ウイルス分離; 分離困難ウイルス; スパイクアダプター法; FIPV; Vero細胞

令和４年度は、令和３年度に発現向上を目指してN末端領域をフォールディングしやすい配列に改良した凸面ライブラリと、研究分担者によって調製されたFIPVを用いて、FIPV結合クローンのセレクションを３ラウンドおこなった。セレクション時は、使用するブロッキング剤、結合クローンの溶出法の改良をおこなった。その結果FIPV結合クローンが8種類得られ、ELISAによるFIPV結合活性、クローンの塩基配列解読をおこなった。クローンの抗原結合部位（パラトープ）のアミノ酸配列の解析からパラトープの配列の特徴がわかった。凹面ライブラリについても、インバースPCRを応用した方法でライブラリ構築を完了させ、ライブラリの評価をおこなった。セレクションに使用する培養細胞（VeroE6）の系を立ち上げた。VeroE6に結合およびインターナライズするクローンのセレクションを２ラウンドおこなったところ、実際にVeroE6細胞内からファージを回収することができた。現在、クローンのパラトープ解析のために必要な塩基配列解析をおこなっている。さらに各クローンについてVeroE6細胞へのインターナライズ活性の定量的評価をおこなっている。

在2020财年，我们将使用凸文库选择三个FIPV结合克隆，其N端区域在2023财年被改进为有利于折叠的序列，目的是提高表达，并由我们的共同研究人员制备的FIPV进行了一轮。 。在选择过程中，我们改进了所使用的封闭剂和结合克隆的洗脱方法。结果，获得了8种FIPV结合克隆，通过ELISA测定FIPV结合活性并测定了克隆的核苷酸序列。对克隆抗原结合位点（互补位）的氨基酸序列的分析揭示了互补位序列的特征。对于凹文库，通过应用反向PCR的方法完成文库构建，并对文库进行评价。我们建立了用于选择的培养细胞系统（VeroE6）。经过两轮选择结合并内化 VeroE6 的克隆后，我们实际上能够从 VeroE6 细胞内部回收噬菌体。目前，我们正在进行克隆互补位分析所需的核苷酸序列分析。此外，定量评估了每个克隆进入VeroE6细胞的内化活性。

项目成果

Construction of LRR-Ab library based on Leucine-rich repeats by module engineering.

通过模块工程构建基于富含亮氨酸重复序列的LRR-Ab文库。

• 发表时间: 2021
• 作者: Haruka Sezaki;Keisuke Yoshinaga.
• 通讯作者: Keisuke Yoshinaga.