内分泌細胞に富む消化管オルガノイドの開発と消化管ホルモンの分泌調節因子の解明

富含内分泌细胞的胃肠类器官的开发和胃肠激素分泌调节剂的阐明

• 批准号: 21K05941
• 负责人: 翁長 武紀
• 金额: $ 2.16万
• 依托单位: Rakuno Gakuen University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05941/
• 关键词: Xenin; 内分泌細胞; オルガノイド; 胃オルガノイド; 小腸オルガノイド; 消化管ペプチド; 腸内分泌細胞; 刺激分泌連関; バイオセンサー

昨年度の報告書に記載した今後の方針に基づいて①胃および②十二指腸粘膜をコラゲナーゼ処理で分散した細胞塊と、③十二指腸粘膜をCa2+キレート法により分散した細胞塊をそれぞれ48穴プレート内のマトリゲルに播種し、Satoら(2018)の報告に基づいたDMEM/F12を基本液とする通常の増殖用培養液で培養した。基本的に胃の細胞培養にはGastrinとFGF-10を添加し、十二指腸の細胞培養にはIGF-IとFGF-2を添加した。増殖用培養液にはマウスrecombinant Wnt3a（mr-Wnt3A）を使用した系とAfamin-Wnt3aを使用した系の2系列を調製し、a.増殖用培養液のみ、b.ニコチンアミド添加、c.ニコチンアミドおよびRHOK-inhibitorであるY-27632の添加条件で培養した。しかし、いずれにおいてもオルガノイドの形成はみられなかったため、途中で培養液のmr-Wnt3a、Afamin-Wnt3aおよびR-spondinの濃度を修正して培養を続けた。さらに新規に細胞を分離して、上記の2系統の基本培養液に加えてY-27632や、p38 MAP kinase inhibitorであるSB202190、GSK inhibitorであるCHIR 99021の添加の有無による細胞増殖への効果も検討したが、いずれもオルガノイドの形成には至らなかった。そこで、上記の無血清培地ではなく、10%ウシ胎仔血清を含むDMEM/F12とL-WRN(Wnt, R-spondin, Noggin)調整培養液を混和したMiyoshiら(2013)の培養方法を基本として、上記の3因子の添加の有無を比較する方法でも同様に検討したが、やはり内分泌細胞に富むオルガノイドを誘導できなかった。培養実験は何れも複数回行ったが、目的とするようなオルガノイドの作製まで至っていない。

根据去年报告中描述的未来政策，胃和（2）十二指肠粘膜的细胞质量通过胶原酶处理分散，（3）十二个肠粘膜分散的细胞肿块CA2+螯合方法是48个孔板，并根据Sato等人的报告播种，并用DMEM/F12进行培养。基本上，将胃蛋白和FGF-10添加到胃的细胞培养中，然后将IGF-I和FGF-2添加到十二指肠的细胞培养中。对于增殖的培养溶液，使用小鼠重组WNT3A（MR-WNT3A）和Afamin-Wnt3a的两种系统是在Y-27632的其他条件下培养的。这是酰胺和抑制剂。但是，由于在任何情况下都没有类器官形成，因此修改并继续培养培养溶液的MR-WNT3A，AFAMIN-WNT3A和R-Spondin的浓度。此外，这些细胞是新分离的，除了上述两种基本培养溶液外，由于添加了添加Y-27632，p38 MAP MAP激酶抑制剂和GSK抑制剂而导致细胞增殖的影响Chir 99021。我们考虑过，但是它们都无法形成器官。因此，它基于Miyoshi（2013）的培养方法，该方法将DMEM/F12和L-WRN（Wnt，R-Spondin，Noggin）调整后的培养物，其中包含10％的胎儿血清，而不是上述Gluish - 通过比较上述三个因素的存在或不存在，但不可能引导富含内分泌细胞的类器官，从而考虑了同样的培养基。所有培养实验均进行多次进行，但没有进行类器官的目的。