大腸菌の新規 yafD-yafE TA system の機能同定

新型 yafD-yafE TA 系统在大肠杆菌中的功能鉴定

基本信息

批准号：
21K05347
负责人：
山口良弘
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Osaka Metropolitan University (2022)Osaka City University (2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

新規 TA system として YafD-YafE を同定し、YafD toxin はRNA ポリメラーゼ活性を阻害することが示唆されている。本研究では、(1) YafD toxin の標的を同定、(2) YafD の標的に対する作用機構、(3) YafE antitoxin によるYafD 毒性中和機構、及び (4) yafD-yafEの生理的役割の解明を目的として実験を行っている。昨年度はYafDタンパク質の可溶化およびyafD 遺伝子のsuppressor gene の取得を試みた。今年度は、suppressor gene の探索の結果得られた2つの大腸菌のゲノム DNA 領域から、suppressor gene の同定を試みた。その結果、ytfP 遺伝子の共発現は YafD による生育阻害を抑制することが示された。一方で、これまでの実験から YafDは RNA 合成を阻害することが示された。今回取得した DNA 領域には RNA ポリメラーゼのオメガ因子である rpoZ が含まれていており、YafD はRpoZ と拮抗阻害して RNA ポリメラーゼと結合することで大腸菌の生育を阻害する可能性が考えられたが、rpoZ 遺伝子は YafD による生育阻害に影響しなかった。YtfP は γ-glutamylamine cyclotransferase family に属する機能未知タンパク質であるため、YafD はアミノ酸合成を阻害していると考えられた。そこで、アミノ酸添加および無添加の M9 合成培地における YafD による生育阻害を解析した結果、アミノ酸の添加は YafD の生育阻害作用を抑制した。よって YafD はアミノ酸合成を阻害していると考えられた。YafD の可溶化タグとして GST、MBPを用いたが、すべて不溶化タンパク質として発現された。

YAFD-YAFE被确定为一种新型TA系统，表明YAFD毒素抑制了RNA聚合酶活性。在这项研究中，我们进行了实验，目的是（1）识别YAFD毒素的靶标，（2）YAFD对靶标的作用机理，（（3）通过YAFE抗毒素中和YAFD毒性的机制，以及（4）YAFD-YAFE的生理作用。去年，我们试图溶解YAFD蛋白并获得YAFD基因的抑制基因。今年，我们试图从寻找抑制基因而获得的两个大肠杆菌基因组DNA区域的抑制基因。结果表明，YTFP基因的共表达抑制了YAFD引起的生长抑制作用。另一方面，以前的实验表明YAFD抑制了RNA的合成。这次获得的DNA区域含有RPOZ，RPOZ是RNA聚合酶的欧米茄因子，人们认为YAFD可以与RPOZ拮抗并与RNA聚合酶结合，从而抑制大肠杆菌的生长，但RPOZ基因对YAFD诱导的生长抑制没有影响。由于YTFP是属于γ-谷氨酰胺环胞素转移酶家族的未知功能蛋白，因此YAFD被认为抑制氨基酸的合成。因此，我们分析了YAFD在添加氨基酸和M9合成培养基中没有添加剂时引起的生长抑制作用，发现氨基酸的添加抑制了YAFD的生长抑制作用。因此，YAFD被认为抑制氨基酸的合成。 GST和MBP用作YAFD的溶解标签，但它们都被表达为不缩短的蛋白质。