マメ科植物プロテアーゼによる根粒窒素固定の制御

豆科植物蛋白酶控制根瘤固氮

• 批准号: 21K05335
• 负责人: 下田 宜司
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: National Agriculture and Food Research Organization
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05335/
• 关键词: マメ科植物; 根粒共生; 窒素固定; 根粒菌; プロテアーゼ

本年度は、窒素固定に異常をきたすミヤコグサsym102変異体の原因遺伝子がコードするプロテアーゼの細胞内局在の解析を試みた。シロイヌナズナのオルソログに関する先行研究、および細胞内局在予測プログラムを用いた解析から、sym102がコードするプロテアーゼはミトコンドリアに局在すると考えられた。そこで、まずミヤコグサの根においてミトコンドリアを可視化するために、MitoTrackerによる染色を実施した。しかしながら、ミヤコグサの根全体において、ミトコンドリアのみをうまく染色することができなかった。次にGFP等との融合タンパク質を用いて、sym102の細胞内局在を解析した。sym102のC末端にGFPを連結した遺伝子を過剰発現プロモーター（カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター）で発現するコンストラクトを作製した。同時に、ミトコンドリアに局在することが知られているシロイヌナズナのF1-ATPase γ-subunitのシグナルペプチドの下流にRFPを連結したコンストラクトを構築した。構築した2つのコンストラクトを毛状根形質転換により、野生型のミヤコグサの根で発現させた。その結果、sym102-GFPおよびF1-ATPase γ-subunit-RFPはともに明確なミトコンドリア局在を示した。同様の実験をsym102変異体でも実施したが、ミトコンドリアへの局在およびシグナルの分布の程度は野生型の場合と同様であった。

今年，我们试图分析具有固氮异常的莲花sym102突变体的致病基因编码的蛋白酶的细胞内定位。先前对拟南芥直系同源物的研究和使用亚细胞定位预测程序的分析表明，sym102 编码的蛋白酶定位于线粒体中。因此，我们首先用 MitoTracker 进行染色，以可视化莲子根中的线粒体。然而，仅对整个莲子根中的线粒体进行染色是不可能的。接下来，我们使用 GFP 等融合蛋白分析了 sym102 的细胞内定位。构建了使用过表达启动子（花椰菜花叶病毒35S启动子）表达在sym102的C末端连接有GFP的基因的构建体。同时，我们构建了一个构建体，其中 RFP 连接在拟南芥 F1-ATPase γ 亚基信号肽的下游，已知该亚基位于线粒体中。两个构建体通过毛根转化在野生型百脉根中表达。结果，sym102-GFP 和 F1-ATPase γ-亚基-RFP 均显示出不同的线粒体定位。对 sym102 突变体进行了类似的实验，但线粒体定位和信号分布的程度与野生型相似。