様々な代謝経路活性の一細胞検出を可能とする新規蛍光イメージング戦略の開発

开发一种新型荧光成像策略，能够单细胞检测各种代谢途径活动

基本信息

批准号：
21K05312
负责人：
内之宮祥平
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度ではシリルエーテル保護基にアルコキシ基を導入することで、従来のフッ化物イオンを検出する蛍光プローブで用いられているシリル保護基（TBS, TBDPSなど）と比較して、フッ化物イオン応答性を500倍以上向上させることに成功した。本年度は論文化に向けて、反応速度論解析やpH応答性、様々なアニオン種との選択性の比較などのデータを得るとともに、アプリケーションとして生体夾雑系において酵素反応に伴い放出されるフッ化物イオンの検出を行った。まずエステラーゼと反応後にフッ化物イオンを放出する基質を用いて、細胞ライセート内でのエステラーゼ活性の蛍光検出に成功した。さらに、脂肪酸を分解する代謝経路であるβ酸化の蛍光検出に取り組んだ。β酸化によって代謝されることでフッ化物イオンを放出する基質を細胞に添加し、細胞を破砕後のライセートにクマリンを有する蛍光プローブを加えたところ、蛍光強度の上昇を確認した。この蛍光上昇はβ酸化の阻害剤を添加した際は検出されなかったことから、本システムを用いてβ酸化活性を検出可能であることが分かった。さらに、クマリン以外の蛍光色素としてナフタルイミドを有するプローブでも蛍光検出が可能であり、様々な蛍光色素でβ酸化を検出可能であることが分かった。現在は本システムを用いた生細胞イメージングを検討中である。生細胞にクマリンを有する蛍光プローブを添加し、続いてフッ化物イオンを添加したところ、細胞内での蛍光上昇を確認した。この蛍光上昇はフッ化物イオンを添加しなかった場合は確認されなかったことから、本システムを用いて生細胞内でもフッ化物イオンをイメージングできることが分かった。

去年，我们在甲硅烷基醚保护基中引入了烷氧基，与检测氟离子的传统荧光探针中使用的甲硅烷基保护基（TBS、TBDPS等）相比，成功提高了氟离子响应性。性能提高500倍以上。今年，为了准备发表论文，我们将获得有关反应动力学分析、pH 响应性以及检测到的各种阴离子种类的选择性比较的数据。首先，我们使用与酯酶反应后释放氟离子的底物成功地荧光检测细胞裂解液中的酯酶活性。此外，我们还致力于β-氧化的荧光检测，β-氧化是一种分解脂肪酸的代谢途径。当将通过β-氧化代谢时释放氟离子的底物添加到细胞中，并在破碎细胞后将含有香豆素的荧光探针添加到裂解物中时，观察到荧光强度增加。当添加β-氧化抑制剂时，没有检测到荧光的增加，这表明可以使用该系统检测β-氧化活性。另外，发现可以使用含有萘二甲酰亚胺作为香豆素以外的荧光色素的探针进行荧光检测，并且可以使用各种荧光色素来检测β-氧化。我们目前正在研究使用该系统的活细胞成像。当将含有香豆素的荧光探针添加到活细胞中然后添加氟离子时，确认了细胞内的荧光增加。当不添加氟离子时，没有观察到荧光的增加，这表明该系统甚至可以用于对活细胞内的氟离子进行成像。