Structural analysis of target proteins based on multifunctional photoaffinity labeling

基于多功能光亲和标记的目标蛋白结构分析

基本信息

批准号：
21K05304
负责人：
友廣岳則
金额：
$ 2.75万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05304/
关键词：
photoaffinity labeling diazirine chemical probe

项目摘要

本研究では、多機能を集積した独自の小型光反応基を改良し、生理活性リガンドのターゲットタンパク質同定効率を向上しつつ、従来法では困難であったリガンド結合ドメインにおける複数ラベル部位同定を達成する。それらラベルアミノ酸残基の位置情報にラベル量情報を加えることで、リガンド相互作用状態の微細な構造変化を追跡し評価し得る、新たな光アフィニティーラベル法（PAL）への展開を図る。初年度、o-ヒドロキシ桂皮酸を母核とし、ジアジリン基導入位置をベンゼン環からアルキル鎖にした新たな発蛍光性光クロスリンカーを開発した。このクロスリンカーを導入したリガンドプローブによるPALでは、従来型に比較してラベル収率が大幅に向上し、さらに酵素活性中心近傍をラベルすることが明らかとなり、ジアジリン基部分の大きさや柔軟性がタンパク質のリガンド相互作用部位ラベルにおいて重要な要因であることが示された。しかし、アルキルジアジリン由来の多様な副反応によりMS解析が極めて複雑化し、大部分のラベル部位が同定困難であった。それら副反応を抑えるため、２年目では新たにトリフルオロメチル置換型アルキルジアジリン誘導体開発に取り組んだ結果、複数の誘導体を合成することに成功した。一方、極微量ラベルタンパク質、および複数ラベル部位解析の効率化を目的とした銅触媒アジド－アルキン環化付加反応（CuAAC）の高速化法の開発では、まずアジド基導入ペプチド銅配位子を最適化した。別途、PALでアルキニル化したタンパク質を調整し、これを用いてCuAACを検討したところ、タンパク質の系においても汎用銅配位子TBTAに比べ、収率と反応速度の大幅な向上が確認できた。

在这项研究中，我们改善了已经积累了多种函数的独特，紧凑的光电反应群，提高了鉴定生物活性配体的靶蛋白的效率，同时在配体结合域中实现了多个标记位点识别，这些识别很难与常规方法相关。通过将标签量信息添加到这些标记为氨基酸残基的位置信息中，我们旨在发展为一种新的光性标签方法（PAL），该方法允许迹线和评估配体相互作用状态的细微结构变化。在第一年，开发了一种新的荧光光叠链链链链链球，其o-羟基霉素为母核，而重氮嘧啶基团从苯环引入了烷基链中。与常规模型相比，使用引入该交联的配体探针的PALS可以显着提高标签的产量，此外，据显示，它们标记了酶活性中心的附近，这表明Diazirin群体的大小和灵活性是二氮杂蛋白群的大小和灵活性，是蛋白质蛋白质互动位点标记的重要因素。但是，源自烷基氮杂的各种副反应使MS分析变得极为复杂，因此很难识别大多数标签位点。为了抑制这些副反应，在第二年，我们致力于开发新的三氟甲基取代的碱性乙烯衍生物，结果，我们成功地合成了多个衍生物。另一方面，在开发一种方法来提高经过超级治疗的标签蛋白和多个标记位点分析的效率时，首先优化了铜催化的叠粉叠氮化物环环化添加反应（CUAAC），叠氮化物组内引导的肽铜配体首次优化。当用PAL分别制备藻类的蛋白质并将其用于研究CUAAC时，与通用铜配体TBTA相比，蛋白质系统中的产率和反应速率显着提高。