Structural analysis of L-amino acid oxidases with strict substrate specificity

具有严格底物特异性的 L-氨基酸氧化酶的结构分析

• 批准号: 21K05278
• 负责人: 稲垣 賢二
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05278/
• 关键词: L-リシン酸化酵素; L-グルタミン酸酸化酵素; 基質認識機構; 成熟化機構; 飽和変異; X線結晶構造解析; L-glutamate oxidase; L-lysine oxidase; processing; substrate specificity; biosensor

放線菌L-グルタミン酸酸化酵素（LGOX）は基質特異性が厳格なため，バイオセンサーとして世界的に利用されている。LGOXの特徴である高基質特異性の要因解明のため，リガンド非結合状態のLGOXの構造解析，ドッキングスタディ，変異酵素の構造解析を通じ，活性中心残基の機能解析と役割の考察を行ってきた．その結果活性中心残基の中で，Arg305が鍵残基であることTrp564及びGlu617の3残基が厳格な基質認識に重要であることがわかった．今回より詳細な基質認識機構を明らかにすることを目的として，LGOXと基質L-Gluの複合体と変異酵素E617Q-LGOXのX線結晶構造解析を行い，基質非結合の構造と比較解析した．2段階のカラム精製を行った高純度酵素サンプルを用いて結晶化・構造解析を行った結果，長年未解明であったLGOXの基質複合体構造を明らかにできた．鍵残基のArg305に加え，His312が基質側鎖カルボキシ基と相互作用しており，この2残基が基質の側鎖認識に重要であることがわかった．さらにGlu617とAsp433がArg305と相互作用しており，Arg305の位置を固定していることがわかった. 以上4対の水素結合からなるネットワークが基質結合時に形成されており，厳格な基質認識に寄与していると考えられる．基質非結合の構造と比較したところ，Asp319－Trp327で構成されるループ構造が，基質結合状態では基質ポケットを覆うように移動していることがわかった．これによりLGOXは基質L-Gluを保持しやすく，高い反応性を示していると考えられた．以上の結果より，基質の側鎖認識を担うArg305，His312を含む水素結合ネットワークと，基質ポケットを覆うように移動するループ構造といった構造的特徴が，本酵素のL-Gluに対する厳格な基質特異性と高い反応性をもたらすと考えられる．

放线症L-谷氨酸氧化酶（LGOX）由于其严格的底物特异性而在全球范围内用作生物传感器。为了阐明LGOX特征的高底物特异性背后的因素，我们研究了主动中心残基的功能分析以及通过LGOX在非配体结合状态的结构分析，停靠研究，对接研究和突变酶的结构分析中的活性中心残基的作用。结果表明，在活跃的中央残基中，ARG305是一个关键残基，三个残基TRP564和GLU617对于严格的底物识别很重要。为了阐明详细的底物识别机制，对LGOX和底物L-GLU的复合物以及突变酶E617Q-LGOX进行了X射线晶体结构分析，并将底物的结构与底物结构进行了比较。使用高纯度酶样品进行了结晶和结构分析，该酶样品已在两列的两个阶段纯化，因此，LGOX的底物复合物的结构已经揭示了多年来未被阐明。除了关键残基Arg305外，HIS312还与底物侧链羧基相互作用，发现这两个残基对于识别底物侧链很重要。此外，发现GLU617和ASP433与ARG305相互作用，并且Arg305的位置是固定的。在底物键合期间形成了由四对氢键组成的网络，并被认为有助于严格的底物识别。与非基板结构相比，发现由ASP319-TRP327组成的环结构迁移以覆盖基板结合状态的基板袋。这表明LGOX更有可能保留底物L-GLU，并表现出高反应性。从以上结果来看，人们认为结构特征，例如含有ARG305和HIS312的氢键网络，这些特征负责识别底物的侧链，以及在底物袋上移动的环结构，导致严格的底物特异性和该酶对L-GLU的高反应性。

项目成果

高基質特異性L-グルタミン酸オキシダーゼの活性中心残基Glu617への変異導入による機能解析

通过将突变引入高度底物特异性 L-谷氨酸氧化酶的活性中心残基 Glu617 进行功能分析

• 发表时间: 2021
• 作者: 角菜々子;渡邉和則;阿部由佳;北松瑞生;大槻高史;KIDOKORO Shun-ichi;矢野佳果，松尾慎作，伊藤菜奈子，今田勝巳，日下部均，根本理子，田村隆，稲垣賢二
• 通讯作者: 矢野佳果，松尾慎作，伊藤菜奈子，今田勝巳，日下部均，根本理子，田村隆，稲垣賢二

高基質特異性L-グルタミン酸オキシダーゼの側鎖認識に関わる残基の機能解析

参与高度底物特异性 L-谷氨酸氧化酶侧链识别的残基的功能分析

• 发表时间: 2021
• 作者: Nakamasu Seita;Kikuma Takashi; Hashiguchi Yuji;Tada Sato ;Sano Kanae;Ito Yukishige;Takeda Yoichi;中山夏女，矢野佳果，上田悠加，今田勝巳，田村隆，稲垣賢二
• 通讯作者: 中山夏女，矢野佳果，上田悠加，今田勝巳，田村隆，稲垣賢二

鞍掛豆 西山浸98-5由来L-メチオニンγリアーゼの発現精製と性質検討

Kurakake 大豆 Nishiyama-ni 98-5 的 L-蛋氨酸 γ-裂解酶的表达纯化及性质研究

• 发表时间: 2021
• 作者: 早乙女 友規; Sawaros Onchaiya;城所 俊一;黒田 裕;S. Takahashi;大川敦司，手嶋琢，松井健二，根本理子，田村隆，稲垣賢二
• 通讯作者: 大川敦司，手嶋琢，松井健二，根本理子，田村隆，稲垣賢二

高基質特異性L-リシンα-オキシダーゼの基質側鎖の認識に関与する残基の機能解析

高底物特异性 L-赖氨酸 α-氧化酶底物侧链识别相关残基的功能分析

• 发表时间: 2021
• 作者: 笠原隆継;Chang Tsung C;浦野清香;Pradipta Ambara R;田中克典;井川優風，若井拓哉，舟橋弘晃，渡邉和則，大槻高史;齋藤雅哉，赤井元気，松本侑也，上田悠加，松田崚汰，今田勝巳，根本理子，田村隆，稲垣賢二
• 通讯作者: 齋藤雅哉，赤井元気，松本侑也，上田悠加，松田崚汰，今田勝巳，根本理子，田村隆，稲垣賢二

ダイズ由来L-メチオニン γ-リアーゼGmMGL1, 2, 3 の大腸菌発現系構築，精製と性質検討

大豆来源的L-蛋氨酸γ-裂解酶GmMGL1、2和3的大肠杆菌表达系统的构建、纯化和表征

• 发表时间: 2021
• 作者: Abe Junpei;Takeda Yoichi;Kikuma Takashi;Kizuka Yasuhiko;Kajiura Hiroyuki;Kajihara Yasuhiro;Ito Yukishige;横山大輝，大川敦司，手嶋琢，松井健二，田村隆，稲垣賢二
• 通讯作者: 横山大輝，大川敦司，手嶋琢，松井健二，田村隆，稲垣賢二