超高感度ユビキタス検査技術による未病とバイオマーカーの相関解明

使用超灵敏普适检测技术阐明症状前疾病与生物标志物之间的相关性

基本信息

批准号：
21K04854
负责人：
笠間敏博
金额：
$ 2.75万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、感染初期のウイルス性呼吸器感染症患者の唾液に含まれるウイルス由来タンパク質の量や、超早期がん患者の血液中に含まれるがん細胞由来マイクロRNAの量など、自覚症状がない未病患者の臨床検体に極めて希薄な濃度で含まれる疾病関連生体分子（バイオマーカー）に関する情報を明らかにするデバイスの開発である。2022年度の目標としていた緩衝液中のタンパク質の超高感度検出を計画通り完了した。イムノアッセイの手順や、非特異吸着防止のためのブロッキング条件などに関する検討を行った。昨年度に作製技術を確立したイムノドットアレイデバイスを用い、今年度は検体中の抗原分子の定量分析を実施し、バイオマーカーの検出感度面での性能試験を行った。性能試験のために、小型コンピュータでペリスタポンプを制御し1 mLの検体を流路に流すシステムを構築した。1 mLの検体に含まれている抗原分子をドットアレイの反応場で捕捉・濃縮し、その後、酵素標識2次抗体と基質を順に流すことで、反応場に酵素基質反応で生じた蛍光色素を蓄積させて、蛍光顕微鏡で観察した。酵素基質反応によって生じた蛍光色素が反応場に蓄積して、反応場が明るい蛍光を発した。一方で複合体ができていない反応場は暗いままであった。蛍光を発する反応場の数N はバイオマーカーの濃度と相関があり、N と抗原濃度の関係から検量線を得ることができた。バックグラウンドのシグナル強度とノイズから統計学的に検出限界を見積もり、バイオマーカーの検出感度を評価した。

本研究的目的是调查病毒性呼吸道感染患者在感染初期唾液中所含的病毒衍生蛋白质的量、以及患者血液中所含的癌细胞衍生的微小RNA的量等主观结果。目标是开发一种设备，揭示有关疾病相关生物分子（生物标志物）的信息，这些生物分子包含在来自症状前患者的临床样本中，浓度极低。 2022年目标的缓冲溶液中蛋白质的超高灵敏度检测已按计划完成。我们研究了免疫测定程序和封闭条件以防止非特异性吸附。利用我们去年建立的生产技术的免疫点阵装置，今年我们对样本中的抗原分子进行了定量分析，并在生物标志物检测灵敏度方面进行了性能测试。为了进行性能测试，我们构建了一个系统，该系统使用小型计算机控制蠕动泵，并将 1 mL 样品流入流路。 1mL样品中所含的抗原分子被捕获并集中在点阵的反应场中，然后酶标二抗和底物依次流动，用酶产生的荧光染料充满反应场。使其积聚并在荧光显微镜下观察。酶-底物反应产生的荧光染料在反应场中积累，使反应场发出明亮的荧光。另一方面，未形成络合物的反应场保持黑暗。发出荧光的反应场的数量N与生物标志物的浓度相关，根据N与抗原浓度的关系可以得到校准曲线。根据背景信号强度和噪声统计估计检测限，并评估生物标志物的检测灵敏度。