Construction of simple biocatalyst for efficient bioconversion

构建用于高效生物转化的简单生物催化剂

基本信息

批准号：
21K04792
负责人：
田島誉久
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K04792/
关键词：
酵素触媒低温菌 GFP 物質変換熱処理膜タンパク質

项目摘要

2022年度は有用物質変換触媒の構築と反応場の解析を実施した。1. 有用物質変換触媒の構築フェルラ酸を変換するシンプル酵素触媒の構築を行った。これまでに構築したシンプル酵素触媒ではバニリンへの変換は可能であるものの、さらなる収率と収量の向上を目指して、遺伝子発現系の改変を行った。2段階での酵素反応のうち、酵素活性が低い酸化酵素をプロモーター直下に配置した発現プラスミドの導入により、生産性の向上が確認された。また、大腸菌のタンパク質発現系に利用されるT7発現システムを構築すべく、T7 RNAポリメラーゼとT7プロモーターを酵素発現プラスミドに導入した。想定された配列の挿入は確認されたものの、酵素の顕著な発現は認められなかった。T7 RNAポリメラーゼの転写活性が確認されなかったことから本系が機能していないことが示され、今後、その他の発現系の導入を含めて発現系の改良を行う。2. 反応場の解析酵素変換の場となる細胞外への酵素漏出について、熱処理による影響を解析した。緑色蛍光タンパク質 (GFP)と融合させて発現させたサイズの異なる複数の酵素タンパク質について、熱処理した細胞懸濁液を遠心分離で上清と細胞画分に分け、GFP蛍光測定により局在を調べた。その結果、サイズの小さなGFPのみでは上清にその大部分が確認されたことから細胞外に漏出したことが示されたが、酵素と融合したものでは細胞外への漏出は低下した。また、本触媒の宿主は海洋性微生物を用いていることから海水での培養を行ったところ、熱処理後の細胞外漏出が低下した。今後、要因となる成分の解析を進め、酵素触媒の培養・反応条件の検討を進める。

在2022财年，我们进行了有用的材料转化催化剂和反应场的分析。 1。有用的物质转化催化剂的构造，我们构建了一种简单的酶催化剂，该酶转化了阿魏酸。尽管到目前为止构建的简单酶催化剂可以转换为香草蛋白，但我们已经修改了基因表达系统，目的是进一步提高产量和产量。在这两种酶反应中，引入表达质粒，其中具有低酶活性的氧化酶直接放置在启动子下方，从而证实了生产率的提高。此外，将用于大肠杆菌蛋白质表达系统中的T7表达系统构建，将T7 RNA聚合酶和T7启动子引入酶表达质粒中。尽管确认了假定序列的插入，但未观察到酶的显着表达。未确认T7 RNA聚合酶的转录活性，表明该系统不正常，将来将改善表达系统，包括引入其他表达系统。 2。对反应场的分析，分析了热处理的效果，以使酶泄漏到细胞外细胞，这是酶转化的位点。对于通过与绿色荧光蛋白（GFP）融合表达的不同尺寸的多种酶蛋白，将热处理的细胞悬浮液通过离心分配为上清液和细胞脱离，并通过GFP荧光测量来检查定位。结果表明，上清液从细胞中泄漏出来，因为大多数泄漏仅由GFP证实，但是与酶融合时，对细胞的泄漏减少了。此外，由于该催化剂的宿主是由海洋微生物制成的，因此在海水中培养时，热处理后的细胞外泄漏会减少。将来，我们将继续分析因素的组成部分，并研究酶催化剂的培养和反应条件。

项目成果

期刊论文数量（17）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

低温菌シンプル酵素触媒の熱処理による酵素漏出の解析

耐冷简单酶催化剂热处理引起的酶泄漏分析

DOI：
发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
0
作者：
羽里知美;高田美帆;西岡美玖;波多野直哉;金山直樹;徳光浩;曲正樹;岡本棟悦，樋口拓哉，鈴木真史，奥谷聡志，鬼塚正義;山口　渉;穴田康太，田島誉久，緋田安希子，加藤純一
通讯作者：
穴田康太，田島誉久，緋田安希子，加藤純一

Cloning, overexpression and purification of a NADP-dependent malic enzyme with unusual thermostability from psychrophile Shewanella livingstonensis Ac10

从嗜冷希瓦氏菌 Livingstonensis Ac10 中克隆、过表达和纯化具有异常热稳定性的 NADP 依赖性苹果酸酶

DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
本田二葉;荒戸照世;新見伸吾;岡村元義;尾山和信;平澤竜太郎;福原彩乃;緒方法親;松田朋子;鬼塚正義;日向昌司;西澤翔;石井敏弘;伊達叡美;入澤朗;羅宮臨風，神田拓己，田島誉久，藤井創太郎，三本木至宏，緋田安希子，加藤純一
通讯作者：
羅宮臨風，神田拓己，田島誉久，藤井創太郎，三本木至宏，緋田安希子，加藤純一

低温菌シンプル酵素触媒の熱処理による細胞構造への影響

耐冷简单酶催化剂热处理对细胞结构的影响