網羅的１分子力学解析法におけるナノ力学の究明とがんマーカー分子診断応用

利用综合单分子力学分析方法研究纳米力学及其在癌症标志物分子诊断中的应用

基本信息

批准号：
21J15199
负责人：
大竹真央
金额：
$ 0.96万
依托单位：
University of Yamanashi
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-28 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J15199/
关键词：
ビーズベースバイオアッセイ物理吸着 DLVO理論力分光法

项目摘要

従来のバイオセンシング技術は無数に生じる分子間反応の平均的挙動を測定パラメータとしており、感度の向上に限界がある。一方、1分子間の結合力測定は原子間力顕微鏡などのマイクロマニピュレーション技術によって報告されてきた。しかし、1結合の測定を行うたびにプローブの操作を要するため、測定スループットが低い。このため、1分子力測定技術は基礎研究的な報告に留まり、応用発展には至っていない。以上の理由から、本研究ではプローブとなるマイクロビーズに遠心力を印加することで1分子間結合力の複数並列測定を実現し、1分子力測定による分子診断技術への応用を目指す。本年度は1分子計測の実証を目指したナノ界面の設計を中心に取り組んだ。これまでの検討によってビーズ―基板間に作用する非特異的な相互作用は、ビーズ分散媒中のイオンによる固体表面電位の遮へいによって生じることが確認されている。そこで、これまで使用していたりん酸緩衝液からHEPES緩衝液に変更することで、分散媒のpH及びイオン強度を独立に変更できる分散媒を調製した。また、1分子測定において使用する粒子径範囲では粒子径の変化による界面の変化の方が体積増加よりも影響が大きく、大きい粒子径を持つビーズの方が基板と吸着しやすいことが確認された。そこで、直径0.1 μmの小さなビーズを使用することで表面の非特異的吸着を抑えた。上記実験系を用いて基板表面に固定したPEG化ビオチン及びビーズ表面に固定したストレプトアビジンの反応性を評価したところ、表面にストレプトアビジンが固定されていないビーズを用いた場合には、非特異的吸着がほとんど見られなかった。また、表面にストレプトアビジンを固定したビーズにおいても基板表面のPEG化ビオチンの有無によってビーズの結合量に違いが見られた。以上の検討から、ビーズ―基板間に生じる非特異的吸着を低減するナノ界面の設計に成功した。

常规的生物传感技术将无数分子间反应的平均行为作为测量参数，并且敏感性的提高有限制。另一方面，已经使用微观消除技术（例如原子力显微镜）报告了分子之间的结合力测量。但是，由于每次测量单个结合，测量吞吐量都很低。因此，单分子力量测量技术只是一份基础研究报告，尚未在应用中开发。由于上述原因，该研究旨在通过将离心力应用于用作探针的微粒，并使用单分子力测量来实现分子间结合力的多次平行测量。今年，我们专注于设计纳米界面，旨在展示单分子测量。先前的研究已经证实，由于珠色散培养基中离子对固体表面电势的屏蔽，珠子和底物之间的非特异性相互作用发生。因此，通过更改迄今为止已用完的磷酸盐缓冲溶液，该溶液已被用作HEPES缓冲液，这是一种能够独立改变色散培养基的pH和离子强度的分散培养基。此外，已经证实，由于单分子测量中使用的粒径范围的变化而引起的界面变化的效果比体积增加更大，并且具有较大粒径的珠子更有可能吸附到底物上。因此，通过使用直径为0.1μm的小珠来抑制表面的非特异性吸附。使用上述实验系统，评估了固定在底物表面和链霉亲和链霉素蛋白上的生物素的反应性。当使用未固定在表面上的链霉亲和蛋白的珠时，几乎没有非特异性吸附。此外，在固定在表面上的链霉亲和蛋白的珠子中，观察到结合的珠子的差异，具体取决于是否在底物表面上的卵形生物素。基于上述研究，我们成功设计了一种纳米接口，该纳米接口降低了珠子和底物之间发生的非特异性吸附。