SHED分泌因子が軟骨細胞の増殖・分化に与える機序を解明する

阐明SHED分泌因子影响软骨细胞增殖和分化的机制

基本信息

批准号：
21J10881
负责人：
村田早羅
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-28 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J10881/
关键词：
細胞外小胞 SHED 軟骨細胞インテグリンβ1 細胞増殖

项目摘要

ヒト乳歯幹細胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth(SHED) ）が放出する細胞外小胞（extracellular vesicles （EVs））をヒト軟骨細胞へ添加後、軟骨細胞の細胞内シグナル伝達の変化とその原因因子の探索を行った。ウェスタンブロッティング解析によりSHEDのEVsの刺激後、軟骨細胞の細胞増殖に関係するERK MAPキナーゼ経路とβ-カテニン経路の活性化を認め、ウェスタンブロッティング解析およびフローサイトメトリー解析により軟骨細胞の増殖に関係する膜表面タンパク質であるインテグリンβ1の発現の上昇を認めた。SHEDのEVsをRNase処理後、軟骨細胞を刺激しても未処理EVsと同様に細胞増殖を促進する結果となったことから、SHEDのEVsの軟骨細胞への影響についてEVs中のタンパク成分に着目した。まず、CRISPRCas9によりSHEDのインテグリンβ1ノックアウト細胞を作製し、ノックアウト細胞由来のEVsで軟骨細胞を刺激したところ、ウェスタンブロッティング解析により軟骨細胞のインテグリンβ1の発現に有意差を認めなかった。次に、SHEDと同様に軟骨細胞のインテグリンβ1ノックアウト細胞を作製した。インテグリンβ1ノックアウト軟骨細胞は未処理の軟骨細胞と比較してBrdU増殖試験により増殖能が低いことがわかった。SHEDのEVsで刺激したところ、BrdU増殖試験およびBrdUセルサイクルアッセイにより、インテグリンβ1ノックアウト軟骨細胞の増殖能は回復を示した。よって、SHEDのEVs中のタンパク成分が軟骨細胞のインテグリンβ1のシグナルを補償または補填することによって、軟骨細胞の増殖能を促進することがわかった。

将人脱落乳牙（SHED）释放的细胞外囊泡（EV）添加到人软骨细胞中后，对软骨细胞内信号转导的变化及其致病因素进行了探索。 Western blotting 分析显示，用 SHED EV 刺激后，参与软骨细胞增殖的 ERK MAP 激酶途径和 β-catenin 途径被激活，Western blotting 分析和流式细胞术分析显示，ERK MAP 激酶途径和 β-catenin 途径被激活。观察到参与软骨细胞增殖的连环蛋白途径，整合素β1（一种膜表面蛋白）的表达增加。用 RNase 处理 SHED EV 后，软骨细胞的刺激与未处理的 EV 一样促进细胞增殖，因此，我们重点研究 EV 中的蛋白质成分，以研究 SHED EV 对软骨细胞的影响。首先，我们使用 CRISPRCas9 生成 SHED 整合素 β1 敲除细胞，并用来自敲除细胞的 EV 刺激软骨细胞，Western blotting 分析显示软骨细胞中整合素 β1 的表达没有显着差异。接下来，以与SHED相同的方式产生软骨细胞整合素β1敲除细胞。通过BrdU增殖测试发现，与未处理的软骨细胞相比，整合素β1敲除的软骨细胞的增殖能力较低。当用SHED EVs刺激时，通过BrdU增殖测试和BrdU细胞周期测定恢复整合素β1敲除软骨细胞的增殖能力。因此，发现SHED EV中的蛋白质成分通过补偿或补充软骨细胞的整合素β1信号来促进软骨细胞的增殖能力。