bFGF对糖尿病溃疡组织中血管内皮细胞氧化应激相关酶调控作用

The incident of diabetes is incresing constantly, and the treatment of diabetic skin ulcer has become a difficult problem in clinic. Nowadays, exogenous growth factor bFGF has successfully been applied to treat diabetic skin ulcer and achieved good curative effect. According to former reports, vascular endothelial cells is one of major bFGF targeted cell type in ulcer skin tissue. However, the mechanism of pathway and network regulation of this process is not yet clear. The former proteomics results showed that bFGF can dramatically up-regulate the expression of GAPDH, and down-regulate the expression of Aldolase, MDH, LDH, what belong to glycometabolism-related enzymes. The expression level and subcellular localization of these proteins are closely related to oxidative stress and apoptosis, which indicate that bFGF may improve proliferation ability, and finally produce reparative effect by regulating the expression or location of these proteins. The purpose of this project is to take further research on the effect of bFGF on the variation of these proteins in vascular endothelial cells injured by high glucose, and then to explore the connection among the mechanism of healing effect of bFGF, oxidative stress, as well as apoptosis. The result of this project will provide a theoretical basis for bFGF application in clinical treatment.

糖尿病发病率日益上升，其并发症糖尿病皮肤溃疡的治疗已成为亟待解决的难题之一。目前，临床已成功将外源性生长因子bFGF应用于糖尿病皮肤溃疡的治疗。bFGF促皮肤溃疡修复的主要靶器官之一是与肉芽组织生长密切相关的血管内皮细胞，但其信号传递途径和网络调控作用机制尚不清楚。前期动物模型蛋白质组学研究显示bFGF可显著上调GAPDH的表达，并下调Aldolase、MDH、LDH的表达，此四种蛋白均为糖代谢相关酶，其表达水平和亚细胞定位又与氧化应激及细胞凋亡密切相关，进而提示bFGF可能是通过调控上述蛋白的表达或定位，来减少细胞凋亡、提高增殖能力，产生促修复作用。本课题旨在前期实验基础上进一步研究bFGF对高糖损伤血管内皮细胞中上述四种蛋白的表达、亚细胞定位及蛋白活性的影响，初步探讨bFGF促糖尿病皮肤溃疡修复机制与氧化应激和细胞凋亡的关系，为bFGF临床应用提供理论依据。

糖尿病的表现主要为血糖的升高。由于血管内皮细胞是直接接触血液的，所以当血糖升高，内皮细胞就会受到损伤。但其机制有待研究。为了分析高糖对细胞迁移的影响，我们在体外用人血管内皮细胞处理高糖模拟糖尿病的情况。我们发现高糖延缓了细胞迁移，诱导了MAPK通路JNK和ERK的磷酸化水平升高。相反，处理bFGF促进了细胞迁移，下调了MAPK的磷酸化水平。此外，加入JNK和ERK的抑制剂保护了高糖损伤的细胞迁移。分子生物学实验证明HG刺激了ROS的产生，而处理bFGF或JNK/ERK抑制剂减少了高糖累积的ROS。加入ROS清除剂，MnTMPyP，不仅减少了高糖刺激的ROS，同时加速了细胞迁移。以上结果表明，受bFGF调控的MAPK被高糖激活，继而导致ROS的积累，细胞迁移的抑制。本研究首次阐述了高糖对血管内皮细胞的损伤分子生物学机制，这无疑促进了糖尿病治疗新方法的发展。.另外，在糖尿病溃疡组织中，bFGF的主要靶细胞除了血管内皮细胞，还有成纤维细胞。因此，我们还使用高糖培养基培养提取的原代人包皮成纤维细胞，体外模拟糖尿病高糖环境，研究糖尿病对创面愈合影响的分子机制。实验显示常规30 mM高糖环境培养成纤维细胞抑制细胞迁移，但不影响细胞增殖。bFGF的强烈促迁移作用，援救了高糖对成纤维细胞的迁移损伤作用。分子和细胞生物学研究显示，高糖增加细胞内ROS水平，抑制JNK磷酸化，并且对Rac1活性表达没影响。bFGF调控细胞迁移时，需要激活JNK和Rac1。蛋白质组学研究鉴定高糖增加的成纤维细胞内特殊蛋白Annexin A2的硝基化修饰水平，并且bFGF信号的激活可以抵制高糖引起的硝基化加重。添加FGFR和JNK抑制剂，延迟成纤维细胞迁移，增加Annexin A2硝基化，表明Annexin A2受bFGF信号调节，通过激活JNK。总的来说，高糖抑制bFGF调控的JNK磷酸化，导致Annexin A2的硝基化程度增加，从而损伤成纤维细胞迁移。.成果：本项目已发表SCI论文5篇，培养硕士研究生2名。综上所述，本项目基本完成了课题规定的任务。

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