二至丸中新型Cathepsin K抑制剂及其调控骨吸收分子机制研究

Cathepsin K (CatK) is a well-defined pharmaceutical target for the treatment of osteoporosis. Recently, we discovered potent inhibitory activities towards CatK in extracts from Chinese herbs such as Fruts Ligustri Lucidi, Herba Ecliptae and in the combination prescription Er-Zhi-wan (EZW). EZW is a common antiosteoporosis formula widely used in China. All inhibitory n-butanol extracts block the collagenase activity of CatK but do not affect other proteolytic activities and thus indicate that the herbal extracts contain exosite inhibitors. The purpose of the study is to isolate and characterize those exosite inhibitors of CatK. Active components will be purified from EZW and identified by HPLC-MS-MS based fingerprinting. Various enzymatic assays such as Z-FR-MCA substrate assay, gelatinase and collagenase assays will be exploited to characterize the specificity of the inhibitors and molecular docking will be performed to study their binding mode in putative exosites. osteoclast cultures will be used to study the cellular activity of the inhibitors, and Western blot and RT-PCR will be applied to investigate the potential effects of the compounds on other anti-osteoporosis mechanisms including various signaling pathways and interaction mechanism between the active compounds of Er-Zhi-wan.

组织蛋白酶K (CatK)是骨质疏松防治药物的关键靶标。前期研究发现临床疗效确切的二至丸及组方药物墨旱莲、女贞子具有抑制CatK活性，它们的正丁醇提取物均能选择性抑制CatK降解胶原活性，而不影响CatK其它酶水解活性，表明提取物中存在非活性位点抑制剂。本课题的目的是在二至丸中筛选出CatK非活性位点抑制剂。通过胶原降解活性为导向的分离鉴定活性成分群，建立HPLC-MS-MS指纹图谱。采用 Z-FR-MCA底物结合，胶原和明胶降解实验确定抑制剂的特性，分子对接模拟确证化合物与非活性位点的结合特征。考察二至丸CatK抑制剂及其配伍对破骨细胞活性，CatK及骨质疏松不同信号通路的关键蛋白(p-ERK、RANK、TRAF6和AP-1)及转录因子(RANK、TRAF6、AP-1、NFATc1和cFos)的表达的影响，阐述CatK抑制剂调控骨吸收分子调控机制和二至丸的CatK活性成分的配伍机制。

骨质疏松症在中国是一种隐形杀手威胁着人们的健康，安全有效的新型抗骨质疏松药物研究一直是热点。组织蛋白酶K (CatK)是骨质疏松防治药物的关键靶标，选择性表达于破骨细胞，降解骨基质胶原，其抑制剂研究发现临床前和临床研究均显示非靶组织副作用而失败。本课题组研究发现CatK新型非活性位点(exosite)抑制剂具有抑制骨胶原降解活性且不影响活性位点(active site)的生物活性。组织蛋白酶K非活性位点抑制剂不存在临床试验发现的活性位点抑制剂的安全性问题，安全性上将优于现有的骨质疏松治疗药物。很多补肾中药为疗效确切的临床常用治疗骨质疏松药物，将可能是一个丰富的、有待开发的选择性新型 CatK抑制剂的化合物资源库。.本课题首先完成了重组人组织蛋白酶K的制备和纯化工艺研究，考察了CatK酶活性和稳定性，可以满足后续CatK的筛选。进一步以抑制组织蛋白酶K活性为导向对二至丸有效成分群的分离和鉴定，对二至丸组方药物墨旱莲和女贞子的乙醇提取物、正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和石油醚部位分离纯化29个活性成分。采用CatK筛选平台，包括Z-FR-MCA底物结合 (活性位点抑制剂)、胶原降解（CatK抑制剂）、明胶降解 (活性位点抑制剂) 和分子对接筛选，得出墨旱莲皂苷IX为潜在非活性位点抑制剂，特女贞苷、羟基苯乙醇、3,4-二羟基苯乙醇为潜在活性位点抑制剂。本研究进一步以体外成骨细胞和破骨细胞模型，发现特女贞苷能显著促进成骨细胞增殖和ALP活性，促进增高OPG/RANKL的蛋白表达。具有促进成骨活性。墨旱莲皂苷IX具有抑制破骨细胞TRAP活性，抑制AP-1和TRAF6表达。本研究还建立二至丸的UPLC和GC-MS指纹图谱，运用中药色谱相似度评价分析，为市售二至丸的全面质量控制和评价奠定基础。本研究以二至丸为突破点，为从传统中药中筛选安全的CatK抑制剂，阐述调节骨代谢机制研究奠定基础。

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