哺乳动物骨骼肌特异性合成启动子文库构建及筛选

结题报告
项目介绍
AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    31060159
  • 项目类别：
    地区科学基金项目
  • 资助金额：
    24.0万
  • 负责人：
    皮文辉
  • 依托单位：
    新疆农垦科学院
  • 学科分类：
    C0602.基因表达及非编码序列调控
  • 结题年份：
    2013
  • 批准年份：
    2010
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2011-01-01 至2013-12-31

项目摘要

构建组织特异性合成启动子，是基因治疗研究的重要内容。本项目革新设计了人工合成启动子文库的构建方案，用于合成有生物学活性的顺势调控元件。选择5个肌源性调控元件（Sp1、myogenin、MEF2、TEF-1和SRF）保守序列 ，合成具有一定几何序列的DNA单链，经磷酸化、退火形成DNA双链，用T4 DNA连接酶随机连接DNA双链，回收DNA片段，将这些片段进行PCR扩增，利用T/A克隆方法，将扩增的DNA片段克隆入牛α-actin基因核心启动子的上游，构建合成启动子文库；用真核基因表达技术，高通量检测报告基因红色荧光蛋白和荧光素酶，Northern验证，体外筛选细胞特异性强启动子；用小鼠骨骼肌电穿孔转基因技术，检测血清中分泌型碱性胎盘磷酸酶，体内检测合成的骨骼肌特异性强启动子，为骨骼肌作为基因治疗的靶器官提供组织特异性强启动子。

结项摘要

利用Golden Gate克隆法，将5个肌源性调控元件（Sp1、myogenin、MEF2、TEF-1和SRF）保守序列随机连接，插入牛α-actin基因核心启动子的上游，获得合成启动子文库。由于小鼠成肌细胞系C2C12脂质体转染效率极低，阻碍了体外活性检测步骤。项目组将继续研究优化C2C12细胞转染方案。.项目重点研究了“Golden Gate”克隆法中如何确定缓冲溶液的问题。由于反应体系中缓冲液对IIS型核酸内切酶和T4 DNA连接酶活性有很大影响，而T4 DNA连接酶在多种限制性内切酶中都有活性。因此，当将IIS型核酸内切酶和T4 DNA连接酶置于同一反应体系中时，可以考虑首选IIS型核酸内切酶缓冲液作为反应体系的溶液，即满足内切酶的活性，也能够满足DNA连接酶活性。

项目成果

期刊论文数量（3）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）
“Golden Gate”克隆法构建靶向载体
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2013-03
  • 期刊：
    中国生物工程杂志
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    梁龙;杨华;杨永林;刘守仁;皮文辉
  • 通讯作者：
    皮文辉
应用“酶切连接”克隆法构建TALEs
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2013
  • 期刊：
    石河子大学学报(自然科学版)
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    梁龙;杨华;杨永林;石国庆;刘守仁;皮文辉
  • 通讯作者：
    皮文辉
TAL效应子应用研究进展
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2012
  • 期刊：
    生物技术通报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    梁龙;皮文辉
  • 通讯作者：
    皮文辉

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其他文献

siRNA干扰绵羊胚胎成纤维细胞Lig4基因增加同源重组载体重连修复效率
  • DOI：
    10.16288/j.yczz.16-074
  • 发表时间：
    2016
  • 期刊：
    遗传
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    王伟;王玉霜;黄兰兰;简子健;王新华;刘守仁;皮文辉
  • 通讯作者：
    皮文辉
绵羊成纤维细胞中TALE-TFs激活β酪蛋白基因启动子研究
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2017
  • 期刊：
    绿洲农业科学与工程
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    皮文辉
  • 通讯作者：
    皮文辉
利用TALE-TFs在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子表达载体
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2014
  • 期刊：
    中国实验动物学报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    皮文辉;梁龙;唐红;张译元;郭延华;王立民;向春和;周平;刘守仁
  • 通讯作者：
    刘守仁
三种检测内源性基因修饰方法比较
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2016
  • 期刊：
    生物技术通报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    李炜杰;杨娇;何高明;王立民;皮文辉;周平
  • 通讯作者：
    周平
TALENs编辑绵羊成纤维细胞FGF5基因
  • DOI：
    10.11843/j.issn
  • 发表时间：
    2015
  • 期刊：
    畜牧兽医学报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    皮文辉;周平;王立民;唐红;郭延华;张译元;刘守仁;王新华
  • 通讯作者：
    王新华

其他文献

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皮文辉的其他基金

调控DNA修复途径影响绵羊胚胎成纤维细胞中基因打靶频率的研究
  • 批准号：
    31560321
  • 批准年份：
    2015
  • 资助金额：
    38.0 万元
  • 项目类别：
    地区科学基金项目
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  • 批准号：
    31360276
  • 批准年份：
    2013
  • 资助金额：
    50.0 万元
  • 项目类别：
    地区科学基金项目

相似国自然基金

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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