星形胶质细胞内Nrf2在小鼠外力性脑损伤后的神经保护作用及其机制研究

Oxidative stress is one of the important mechanisms of secondary injury after traumatic brain injury (TBI). Nrf2 is the central regulator of cellular antioxidant response, which could be activated after TBI and exerted neuroprotective effects through regulating antioxidant enzymes and inflammatory responses. Astrocyte (AS) is the important component of antioxidant system in brain. Our previous studies have found that Nrf2 was activated in astrocytes after TBI and the deletion of Nrf2 lead to more reactive astrocytes after TBI, but the mechanism is unclear. Therefore, we hypothesize that astrocytic Nrf2 would disturb the reactive astrogliosis after TBI，astrocytic Nrf2 would play neuroprotective role against TBI-induced blood brain barrier damage, inflammantory response and neuronal apoptosis and autophagy through regulating antioxidant response, inhibiting inflammation, removal of excitatory amino acid, and so on. Our studies intend to explore the roles and mechanisms of astrocytic Nrf2 on the reactive astrogliosis and its function by using conditional knockout or overexpression of Nrf2 in astrocytes following TBI model in mice or scratch injury in mouse primary cultured astrocytes, which would further clarify the mechanism of Nrf2 regulated neuroprotective effects after TBI. In addition, the dynamic expression of oxidative stress- related factors and the specific moleculars in reactive asrocytes would be detected and analyzed , which would provide a candidate biomarkers for diagnosis of TBI in forensic pathology.

氧化应激是外力性脑损伤（TBI）后继发性损伤的重要机制之一。Nrf2是细胞抗氧化反应的中枢调节者，在TBI后可被激活并通过调控抗氧化酶、炎症反应等发挥神经保护作用。星形胶质细胞（astrocyte, AS）是脑内抗氧化体系的重要组成。我们的前期研究发现TBI后Nrf2在AS内持续表达，Nrf2缺失导致TBI后更加明显的AS活化，其机制尚不清楚。因此，我们提出假设：AS内Nrf2影响TBI后AS的活化，并通过调控抗氧化、抑制炎症、清除兴奋性氨基酸等，影响血脑屏障、炎症反应和神经元的凋亡和自噬等，发挥神经保护作用。本项目拟应用星形胶质细胞Nrf2特异性敲除和过表达小鼠及原代细胞，分别制作TBI模型和体外划伤模型，研究Nrf2对TBI后AS活化及其功能的影响，阐明Nrf2在TBI后发挥神经保护作用的机制；同时分析氧化应激相关因子和活化AS的反应规律，探寻法医病理学颅脑损伤诊断的分子标记。

氧化应激是继发性颅脑损伤的重要机制之一。Nrf2是细胞抗氧化反应的中枢调节者，研究表明Nrf2介导的细胞抗氧化反应和抗炎反应在TBI后发挥神经保护作用，星形胶质细胞（AS）是大脑内抗氧化反应最重要的胶质细胞，其内NRF2的作用尚不清楚。在本项目的支持下，我们完成了3部分实验。1.通过制作星形胶质细胞内Nrf2特异性敲除（Nrf2(G)-KO）以及星形胶质内NRF2过表达（Nrf2(G)-OE）小鼠，应用颅脑打击器制作CCI模型。我们的研究发现TBI后NRF2在AS内持续性表达。星形胶质细胞 Nrf2 特异性敲除和过表达对生理状态下脑内星形胶质细胞的形态和数目无影响。在Nrf2(G)-KO中，TBI导致更加明显的AS活化及A1型转化；同时还引起小胶质细胞活化、炎症水平增高和吞噬能力增强以及神经元更为明显的损害。在Nrf2(G)-OE小鼠中，Nrf2的过表达减弱了TBI导致的AS的活化和A1转化，同时在伤后14天，皮质损伤周边区会形成明显的胶质瘢痕。过表达NRF2可以明显降低星形胶质细胞在损伤周边区胶质瘢痕的形成，促进星形胶质细胞在损伤后树突的出现，DMF处理同样也缓解了TBI后胶质瘢痕的形成。星形胶质细胞内NRF2也缓解了神经元的死亡和小胶质细胞的活化，使损伤部位减少。2.TBI后血脑屏障的破坏与继发性神经损伤密切相关，我们通过脑室内注射病毒制作内皮细胞特异性敲除Nrf2的动物并制作TBI模型，我们发现内皮细胞内NRF2影响TBI后紧密连接蛋白表达，通过转录调控ZO-1的表达，在TBI后内皮细胞紧密连接的损害过程中发挥保护作用。3.我们通过建立Nrf2基因敲除的APP/PS1+小鼠，研究NRF2对认知障碍模型动物的影响，研究发现Nrf2基因敲除后，模型小鼠认知功能减低及海马区Aβ与p-tauS404表达增加，其机制与小鼠海马区胶质细胞增加和炎症反应增强以及氧化应激反应加重密切相关。综合以上，我们得出结论：星形胶质内的NRF2缓解了TBI引起的星形胶质细胞的过度活化和A1型转型，抑制TBI晚期纤维型星形胶质细胞的转型，降低TBI的炎症反应，发挥了神经保护作用。内皮细胞内NRF2通过转录调控ZO-1在TBI后脑水肿的发生其保护作用。NRF2的细胞特异性时空表达有利于推断颅脑损伤过时间。NRF2的精准调控和细胞特异性的表达调控，有利于对TBI后的治疗提供新的思路。

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