指状青霉生物转化柠檬烯生产alpha-松油醇的分子机制研究

The consumption of natural flavors and fragrances become more and more widely along with the increase of people's health awareness. Natural flavours can be produced through biotransformation or bioconversion. It is reported that limonene could be converted into their more valuable oxygenated derivatives via biotransformation, such as α-terpineol. While the key enzymes and molecular mechanisms of the biotransformation is still ambiguous. The products of the biotransformation are complex with low yield. The present study is to investigate the pathway and molecular mechanism of biotransformation from limonene by Penicillium digitatum DSM 62840. The modern separation and detection technologies as well as the biological mass spectrometry will be used. The key enzymes formed in the biotransformation will be identified, and the amino acid sequence of these enzymes will be detected. The cloning genes will be prepared to exogenous expression in order to obtain enough amounts of these enzymes. The enzymatic reaction system model will be prepared to investigate the function of the key enzymes. In addition, the change regulations and influencing factors of the products and enzyme activities will be studied. After these investigations, the molecular mechanism and regulation mechanism of the biotransformation from limonene by Penicillium digitatum DSM 62840 will be clarified. The present study will lay a theoretical basis to the control of biotransformation of limonene to α-terpineol using metabolic engineering.

随着人们健康意识的增强，天然香料的应用日益广泛，而通过微生物的生物转化作用生产的香料被认为是天然的。微生物转化能够将品质不高的柠檬烯转化成α-松油醇等应用价值更高的香料，然而目前微生物转化柠檬烯生产α-松油醇的关键酶类物质还不清楚，转化机制仍不明确，生成的产物成分复杂，所得到的转化产物的产率仍然很低。本项目拟以柠檬烯为研究对象，利用指状青霉进行生物转化，并采用现代分离及检测技术和生物质谱序列分析手段，确定转化过程中的关键酶类物质，分析其氨基酸序列，克隆其基因，进行外源表达以获取足量的代谢关键酶，通过建立和研究模拟酶促反应体系，明确关键酶在柠檬烯生物转化中的作用及反应产物，并研究柠檬烯生物转化过程中的产物种类及产量与关键酶活性的变化规律及其影响因素，阐明微生物转化柠檬烯的分子机制，为利用代谢工程对微生物转化柠檬烯生产α-松油醇奠定理论基础。

随着人们健康意识的增强，天然香料的应用日益广泛，而通过微生物的生物转化作用生产的香料被认为是天然的。微生物转化能够将品质不高的柠檬烯转化成α-松油醇等应用价值更高的香料，然而目前微生物转化柠檬烯生产-松油醇的关键酶类物质还不清楚，转化机制仍不明确，生成的产物成分复杂，所得到的转化产物的产率仍然很低。本项目开展了柠檬烯转化菌种的筛选与鉴定研究，从不同来源菌种中筛选并得到了能够在以柠檬烯为唯一碳源和能源的培养基上生长，并能够以柠檬烯为底物进行生物转化的微生物菌种，并对菌种进行了鉴定，对其转化条件进行了优化。以指状青霉（Penicillium digitatum DSM 62840）为研究对象，对其转化柠檬烯生成α-松油醇过程中的关键酶（柠檬烯转化酶）进行了提取和探索，确定了酶的位置并利用去污剂进行了增溶，并对该酶进行了分离纯化。对柠檬烯转化酶进行初步探索。试验结果表明，柠檬烯转化酶的最适温度为10℃，在10℃-30℃的温度范围内具有良好的热稳定性；最适pH 为6.0，在pH 4.0-6.0的范围内相对活力保持在88%以上。大多数金属离子对柠檬烯转化酶具有促进作用，其中，2 mM 的Fe3+能够使酶活性显著增加，5mM的Fe2+使酶活性显著下降。有机溶剂对柠檬烯转化酶的抑制作用随浓度的增加而增强，5%的异丙醇和氯仿几乎使酶活性完全丧失。金属离子螯合剂EDTA、铁离子螯合剂2-2´联吡啶和8-羟基喹啉均对柠檬烯转化酶有抑制作用，细胞色素P450 酶抑制剂酮康唑和美替拉酮使柠檬烯转化酶活性显著降低；经底物柠檬烯诱导培养后，柠檬烯转化酶活性显著增加，说明该酶是可诱导的。据此初步推测Penecillium digitatum DSM62840 转化柠檬烯生成α-松油醇过程中的酶可能是一种细胞色素P450 单加氧酶。此外，还开展了指状青霉Penicillium digitatum DSM62840生物转化柠檬烯生产α-松油醇的分子机制研究。以P. digitatum DSM62840为研究对象，通过基因组测序、转录组分析以及蛋白分离纯化和生物信息学分析等手段挖掘柠檬烯微生物转化生产α-松油醇过程中的关键基因。并利用RNAi技术对基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的功能进行研究。

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