拟穴青蟹一种阴离子抗菌肽在精子和卵子成熟过程中的作用研究

绝大多数抗菌肽具有多重功能。Scygonadin是从我国重要海水养殖种类- - 青蟹精浆中分离的一种阴离子抗菌肽，在射精管中特异性表达，被认为具有生殖和免疫双重功能。该基因表达不受病原生物感染所诱导诱导，在青蟹繁殖高峰期时却大量表达，并能在青蟹交配后转移到雌蟹体内，因此，可能在青蟹精子和卵子成熟过程中起重要作用。项目拟通过分析抗菌肽Scygonadin与精子（荚）的结合方式、比较敲减该基因对精子成熟的影响，和解析其互作蛋白等研究，揭示Scygonadin在精子成熟过程中的作用。同时，通过比较自然交配和人工引入Scygonadin后，其在雌蟹生殖系统中的消减规律和卵细胞发育变化，以及雌性生殖系统对其产生的分子响应等研究，揭示Scygonadin在卵子发育和成熟过程中的作用。本项目研究成果将极大地丰富青蟹的生殖生物学知识，为解决青蟹人工育苗中的胚胎质量和发育不同步等关键问题提供科学依据。

Scygonadin是本人从拟穴青蟹（简称青蟹）中分离并命名阴离子抗菌肽。前期研究获得其全长cDNA序列539 bp，由3个外显子共同编码一个102肽；重组表达抗菌肽具有明显抗藤黄微球菌和嗜水气单胞菌等活性；该基因主要在雄性成蟹的生殖系统，尤其射精管中转录表达，表达峰值与青蟹繁殖季节一致。然而，其转录表达不受病原细菌及真菌等诱导。推断抗菌肽不仅具有抗菌活性而且参与青蟹生殖过程，并具独特的转录表达调控机制。本项目旨在明晰其在精子成熟和卵子发育过程中的作用及表达调控机制。主要成果如下：.1、Scygonadin主要在射精管上皮细胞中表达，分泌贮存于射精管Scygonadin转录子集中表达于雄性成蟹生殖系统后半段，其中射精管最高是后射精管（次高量）的2500倍；此外，该基因在雌性成蟹中少量表达，其在最高表达肝胰腺中的拷贝数仅为射精管的1/10000。该抗菌肽雄性成蟹射精管中含量最高，除了分布于射精管和阴茎的内容物外，射精管内壁柱状腺上皮细胞中也可检测。分离射精管不同细胞，发现上皮细胞层scygonadin表达量最高，而在精荚中仅痕量表达。.2、Scygonadin主要作用于青蟹精子成熟过程 抗菌肽Scygonadin仅具有成熟精子（精荚）的成蟹射精管和阴茎中检出，而无法在缺乏成熟精子的精巢和贮精囊中检出；性未成熟青蟹射精管中Scygonadin表达（mRNA和肽）水平低于成蟹，交配后低于交配前；烫灼眼柄后第7 d，射精管内壁局部柱状腺上皮细胞层增厚，成熟精子比例增加，射精管中Scygonadin表达（mRNA和肽）明显高于对照组。.3. Scygonadin主要作用于卵子发育过程 雌性成蟹交配前无法检测到该抗菌肽，交配后其阴道内容物和纳精囊中可检出该抗菌肽；交配后卵细胞继续发育，纳精囊中Scygonadin mRNA数量上升；早期胚胎中可检出少量Scygonadin转录子，然而在胚胎及幼体阶段均无法检出该肽。.3、孕酮显著诱导Scygonadin基因的转录表达 孕酮可极显著诱导该基因表达，而17β-雌二醇和睾丸酮等性类固醇激素无法诱导；在该基因上游发现GATA-1和STAT1等与精子发育相关转录因子结合位点。.4、鉴定生殖免疫相关的重要基因 发现青蟹中存在3个基因组织和表达特性不同的GILT同源基因和2个凝集素新基因；克隆和鉴定了1个DDT基因，其为节肢动物中的首次报道。

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