线粒体ATP 依赖的Lon 蛋白酶与DnaK/DnaJ 分子伴侣系统在线粒体蛋白降解中的协同作用

It is crucial for the cell metabolism to eliminate the abnormal mitochondrial proteins promptly. Mitochondrial proteins are highly susceptible to.oxidative damage, which causes protein aggregation,conformational defects,misfolding, etc. The surveillance system that oversees mitochondrial protein quality control is composed of ATP-dependent proteases, which degrade abnormal and damaged proteins, as well as molecular chaperones, which mediate protein folding and facilitate protein degradation.Within the mitochondrial matrix the ATP-dependent proteases Lon selectively degrade both normal and abnormal proteins to maintain the cell metabolism in order. Our The mitochondrial matrix chaperones Mortalin and Tid1, function together to fold nascent polypeptides,protein disaggregating and refolding. But, the cooperation of ATP-dependent Lon protease with Mortalin/Tid1 in the degradation of abnormal proteins is still unknown. Understanding this cooperation degradation mechanism is critical for us to eluciate the mitochondrial matrix proteins degradation. This project applies the techniques of biochemistry, cell biology and proeomics to study the cooperation of Mortalin and Tid1 with Lon protease in mitochondrial matrix proteins degradation, to identify the endogenous substrates and phosphorylation of mitochondrial matrix proteins, which will lay the foundation for the treatment of diseases related to misfolding and aggradation of mitochondrial proteins.

线粒体异常蛋白及时清除对细胞代谢至关重要。线粒体是细胞中活性氧主要产生场所，线粒体蛋白面临不断增加的氧化损伤威胁，导致蛋白聚集、构象改变及错误折叠等。线粒体蛋白质量控制系统中的分子伴侣DnaK(Hsp70)/DnaJ(Hsp40)与ATP 依赖蛋白酶协同确保该系统正常运行。Lon位于线粒体基质，选择性降解异常蛋白，维护细胞代谢有序。我们前期研究结果发现，细胞中下调Lon 蛋白酶导致线粒体蛋白聚集；Lon 还通过调控线粒体转录因子A 来维护线粒体DNA。线粒体分子伴侣Mortalin 和Tid1 可以帮助新生肽链折叠、聚集蛋白解聚及重新折叠成为天然蛋白，它们和ATP 依赖蛋白酶协同参与线粒体蛋白降解至今尚无涉及，明确其协同降解机制对全面了解和阐明线粒体蛋白降解有重要意义。本课题将对Mortalin 和Tid1 在Lon 降解蛋白过程中的协同作用进行系统研究，并确定其内源底物及磷酸化等修饰。

线粒体基质异常蛋白及时清除对细胞代谢至关重要。由于线粒体是活性氧主要产生场所，线粒体蛋白面临不断增加的氧化损伤威胁，导致蛋白聚集、构象改变及错误折叠等。衰老、肿瘤、神经退行性疾病等都与线粒体异常蛋白的积累相关。线粒体质量控制系统通过热休克反应、未折叠蛋白反应、线粒体融合分裂、线粒体自噬等多种方式修复清除错误折叠、氧化损伤的蛋白，甚至整个细胞器，以维持细胞内环境稳定，减少细胞死亡。线粒体蛋白质量控制系统主要由DnaK/DnaJ (Mortalin/Tid1)分子伴侣系统和ATP依赖的蛋白酶组成。Mortalin/Tid1分子伴侣系统能够重新折叠线粒体基质中错误折叠或聚集的蛋白，恢复蛋白活性。而Lon蛋白酶是线粒体中重要的ATP依赖的蛋白酶，它能够降解未折叠和错误折叠的蛋白，维持线粒体稳定。两者之间相互交流的通畅及精确调控，是确保该系统正常运行，细胞及机体健康的关键。这两种机制如何协同参与线粒体蛋白降解目前尚未研究，因此明确其协同降解机制对了解和阐明线粒体蛋白降解机制有重要的作用，为寻找调控清除线粒体中异常蛋白的药物奠定基础，为治疗与线粒体蛋白异常相关的疾病带来希望。.本项目研究中，（1）我们对蛋白对的表达、纯化进行了系统的优化，利用中高压液相系统，Ni-NTA凝胶纯化能够得到高浓度和高纯度的蛋白；（2）应用ATP酶试剂盒及蛋白底物证明纯化的Lon蛋白酶具有酶活性；（3）我们研究首次发现：Tid1-L和Tid1-S能够促进Lon的蛋白酶活性，但不能促进肽酶活性。我们推测Tid1L和Tid1-S会根据底物不同结合在不同底物上，并将其运输到Lon蛋白酶中进行降解，但它们不能转运短的多肽。研究进一步发现：Mortalin对Lon的蛋白酶活性和肽酶活性没有促进作用，说明Lon降解正常的蛋白时，Mortalin并不会起到分子伴侣的作用。 但是，Mortalin和Tid1-L/S均能够促进Lon蛋白酶降解细胞内的聚集蛋白。我们还发现了Lon能够在体外降解Tid1-L和Tid1-S，但不能降解Mortalin。因此我们可以认为，线粒体基质中的关键蛋白酶Lon也有其底物特异性，线粒体基质中的蛋白质降解需要依靠多种蛋白酶/辅助分子伴侣的协同作用。

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