甲状腺球蛋白在蛋白质二硫键异构酶的条件下可逆性多聚化及氧化还原作用调节机制研究

Fate of nascent thyrolglobulin (Tg) molecule characteristics may be reversible multimerization. The formation of Tg multimers may be subjected to protein disulfide isomerase (PDI)-mediated multimerization. Independently, the exposure of partially unfolded Tg to GSH resulted in Tg multimerization, enhanced by PDI, according to thiol-disulfide exchange. Thus, it is implied that intermolecular disulfide linkage may be facilitated at a limited region of unfolded Tg. In an attempt to examine the multimerization site, three cysteine residue-rich fragments of Tg were subjected to GSH-induced multimerization; Subsequently, the reductive reversal of Tg multimers will be to examine; Tg multimers, prepared from deoxycholate-treated/reduced Tg, is reductive reversal by PDI/GSH system, while reductive reversal of Tg multimers, generated from either partially unfolded Tg or unfolded/reduced Tg, required a prior treatment with glutathione reductase or glutaredoxin. Additionally, thioredoxin/thioredoxin reductase system also reductive reversal either type of Tg multimers. Taken together, it is suggest that Tg multimers can be formed through at least two processes, the direct oxidation by PDI and the thiol-disulfide exchange, and that the reductive reversal of Tg multimers differs according to the type of Tg multimers. Next, we will be to develop a procedure for identifying endogenous oxidizing regulator that cause the oxidation of reduced PDI, and endogenous alkylators which inactivate PDI with cysteine residues of a low pK value. The former procedure is based on the fact that cysteine residues of PDI are easily oxidized in oxidizing condition. This method wil be enable us to screen endogenous oxidation regulator, which can effect the function of PDI. Such endogenous oxidants or alkenaldehydes are supposed to affect the molecular fate of Tg, which is crucial for the generation of normal Tg molecules.

新生的甲状腺球蛋白分子移动可与可逆性多聚化有关。另外，甲状腺球蛋白结构的变化和蛋白质二硫键异构酶的作用可直接影响甲状腺球蛋白的多聚化，而部分展开的甲状腺球蛋白在甲状腺球蛋白的特定部位里以巯基二硫键交换反应原理发生甲状腺球蛋白的多聚化反应。甲状腺球蛋白多聚体的可逆性还原是通过混合二硫键存在的中间体的形成而进行。蛋白质二硫键异构酶认为是在内质网里参与可逆性甲状腺球蛋白多聚化的主要酶。通过氧化还原调节及抑制因子的实验，可确定氧化调节剂或内在碱化剂影响可逆性甲状腺球蛋白多聚化。氧化过程特别活跃的甲状腺组织细胞内氧化调节剂或碱化剂导致蛋白质二硫键异构酶活性的低下，随之阻碍内质网内的甲状腺球蛋白分子移动和甲状腺球蛋白折叠。因此，甲状腺球蛋白与蛋白质二硫键异构酶的共价修饰及可逆性结构演变过程的生化机制对甲状腺激素分泌提供可控的科学依据。所以，本研究将对可控甲状腺疾病提供很好的科学理论依据。

新生甲状腺球蛋白分子命运的特点是可逆性多聚化。本课题通过蛋白质分离、精制、检测的方法，酶活性测定、调节的方法，电泳的方法等蛋白质生物化学的方法与技术，对甲状腺球蛋白在蛋白质二硫键异构酶条件下可逆性多聚化生化机制进行了初步研究。首先建立了部分展开-还原、脱氧胆酸处理-还原的甲状腺球蛋白经过蛋白质二硫键异构酶介导的多聚化。氧化型谷胱甘肽-蛋白质二硫键异构酶介导的甲状腺球蛋白多聚体形成，需要至少相等摩尔比率的蛋白质二硫键异构酶-甲状腺球蛋白单体，随谷胱甘肽浓度的增加而减少。蛋白质二硫键异构酶-甲状腺球蛋白摩尔比率3时表示快速的多聚化，表明蛋白质二硫键异构酶的催化氧化作用。蛋白质二硫键异构酶增强谷胱甘肽导致的部分展开甲状腺球蛋白通过巯基二硫键交换的多聚化。这暗示分子间二硫键可能易化展开甲状腺球蛋白的有限区域。随后，进行甲状腺球蛋白多聚体的还原性逆转；用蛋白质二硫键异构酶-谷胱甘肽系统还原性逆转脱氧胆酸处理-还原甲状腺球蛋白准备的多聚体。部分展开甲状腺球蛋白或展开-还原甲状腺球蛋白生成的多聚体还原性逆转，需要先用谷胱甘肽还原酶或谷氧还蛋白处理。此外，硫氧还蛋白-硫氧还蛋白还原酶系统也可以还原性逆转任何类型的甲状腺球蛋白多聚体。结果显示甲状腺球蛋白多聚体由蛋白质二硫键异构酶直接氧化和巯基-二硫键交换来形成，并且甲状腺球蛋白多聚体根据甲状腺球蛋白多聚体的不同类型而还原性逆转。下一步，我们确定了氧化调节剂(1，2-萘醌或核黄素)氧化还原型蛋白质二硫键异构酶和烷化剂（丙烯醛或4-羟基壬烯醛）在低pK值半胱氨酸残基情况下灭活蛋白质二硫键异构酶活性。即，还原型蛋白质二硫键异构酶在中性pH中易氧化，氧化型蛋白质二硫键异构酶对烷化剂不敏感不易烷基化。这种内源性氧化剂或烯属烃醛可以影响甲状腺球蛋白分子命运，这对正常甲状腺球蛋白分子的产生至关重要。综合上述结果，本研究为新生甲状腺球蛋白在蛋白质二硫键异构酶介导的可逆性多聚化生化机制奠定了坚实的工作基础。同时对蛋白质二硫键异构酶氧化还原作用调节机制提供了重要的启示性线索。项目资助待发表SCI论文和核心论文各一篇。培养硕士生3名，其中2名已经取得硕士学位，1名在读。项目投入经费48万元，支出33.631214万元，各项支出基本与预算相符。剩余经费14.368786万元，剩余经费计划用于本项目研究后续支出。

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