微生物精氨酸脱亚胺酶的改造和药用活性研究

精氨酸脱亚胺酶（ADI）是一种发现于原核和厌氧真核生物中的精氨酸降解酶。近年的研究表明该酶对精氨酸营养缺陷型的肿瘤有显著的抑制作用。美国凤凰药理学公司已经将来源于支原体的重组ADI制剂用于目前尚缺乏有效药物的肝细胞癌和黑素瘤的Ⅱ/Ⅲ期临床试验，疗效良好。因此，ADI被认为是一种非常有潜力的抗癌新药。.本课题组从我国运河水中筛选到一株高产ADI的变形假单孢菌Pseudomonas plecoglossicida CGMCC2039，实现了该酶在大肠杆菌中的重组表达，体外和体内实验均表明该酶对肝癌细胞有明确的抑制作用。为提高该ADI作为抗癌药物的体内活性和半衰期,本课题拟对该酶进行分子定向改造以提高其在生理中性pH下的活性，并对其进行人血清白蛋白融合修饰研究以提高其在生物体内的半衰期。本课题对开发有良好应用前景和自主知识产权的蛋白质抗癌新药有重要的意义。

精氨酸脱亚胺酶是精氨酸营养缺陷型肿瘤的热门靶向治疗药物。目前，支原体来源的ADI-PEG-20已用于肝癌和黑素瘤的Ⅲ期临床研究。.本研究将变形假单胞菌来源的ADI基因克隆并在大肠杆菌中获得高效表达，经两步柱层析纯化后获得纯酶，其比活达20.9 U/mg，为同源二聚体，分子量92.6 kDa。该rADI的最适pH为6.0，在pH 7.4时活性降至10%以下，且Km值为2.88 mmol/L，高于人血清精氨酸浓度20倍以上，因此该ADI的高Km值及生理条件下酶活力较低的性质成为其抗癌活性研究的限制性因素。.采用多种蛋白质工程改造方法对ADI进行性质改良。首先，采用易错PCR法构建随机突变库，结合高效灵敏的高通量筛选模型。经过第一轮定向进化获得一株酶学性能改良的ADI突变株M314，其在pH 7.4下的酶活力较WT提高近20倍，最适pH由6.0提高至6.5，Km值下降至0.65 mmol/L。随后利用定点突变法分别对以上三个突变位点对蛋白质结构和活性影响机制进行分析研究。在M314的基础上进行再一轮的易错PCR，并通过高通量筛选得到突变株M173，其在pH 7.4下的比活较出发菌株M314提升了36.59%，且kcat/Km值提高了52.36%。随后结合蛋白空间结构及相关催化机制分析，通过理性设计定点突变，最终获得组合位点优势突变株M13-2，其生理pH条件下的比活较M314提高了1.35倍，较WT提高了44倍，最适pH也同时较WT（pH 6.0）与M314（pH 6.5）进一步提高至7.0。随后，对理性设计所获的关键位点建立半理性饱和突变库进行筛选，最后由162位点的饱和突变库中筛选得到的M13-3以及M13-4均带来了24%左右的可溶性蛋白量的增加。.针对ADI作为抗肿瘤药物的两个主要问题：血浆中循环半衰期（约4 h）短以及强免疫原性，本研究同时尝试多种20 kDa的PEG修饰剂包括：mPEG-SS、mPEG-SC、mPEG-SPA等，对ADI成功进行修饰，结合度几乎达到100%，结果显示PEG-ADI在耐热及耐酸碱性方面有较显著增强。.综上，本研究采用蛋白质工程和PEG修饰等方法对ADI在生理pH条件下的酶活、酶学性质和半衰期等进行改造，为蛋白质的分子改造策略提供了理论基础和实验依据，对开发有良好应用前景和自主知识产权的蛋白质抗癌新药有重要的意义。

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