调控荷叶碱合成的莲NnWRKY70转录因子鉴定及功能解析

Alkaloids in lotus leaf have been paid much attention for long time due to their significant effects on reducing blood pressure and blood lipids. At present, the study of the nuciferine, one of the major alkaloids in lotus leaf, is mainly focused on developing extraction and purification methods, analyzing its chemical structure and pharmacological activities. However, nuciferine biosynthesis and regulation mechanism have not been studied yet. Based on lotus leaf transcriptome data from a high alkaloid cultivar‘BJ’and a low alkaloid cultivar‘WD40’,one WRKY transcription factor, NnWRKY70, is identified, and the mechanism by which NnWRKY70 regulates nuciferine biosynthesis will be explored extensively. By using detection system in yeast, in vivo validation and transgenic analysis, we aim to elucidate the function of NnWRKY70 in regulating nuciferine biosynthesis, and the other NnWRKYs which interact with NnWRKY70 in its regulation networks will be also identified. In addition, signaling pathway in regulation of nuciferine biosynthesis by NnWRKY70 will be clarified via wounding and hormone treatment. This research can not only help us to understand the molecular mechanism of alkaloids synthesis regulation by NnWRKY70, but also have important practical significance to make full use of aquatic plant lotus to develop nuciferine-abundant varieties in the future.

荷叶生物碱因其在降压、降脂方面的显著功效，一直以来备受关注。目前对荷叶碱的研究集中在化学结构的分析、分离纯化以及药理活性分析方面，对其在植物莲中的生物合成及其调控机制尚未开展研究。本项目依据高荷叶碱莲品种‘BJ’和低荷叶碱莲品种‘WD40’的叶片转录组数据，筛选出莲转录因子NnWRKY70，对其在荷叶碱生物合成中的调控机制展开深入研究。通过酵母单双杂交互作检测、体内验证以及转基因分析，挖掘NnWRKY70在调控荷叶碱合成中的功能和规律，筛选与NnWRKY70可能互作的其它NnWRKY蛋白，构建莲WRKY基因控制荷叶碱合成的调控网络。同时，明确外伤或者外源MeJA处理下NnWRKY70调控荷叶碱合成的激素信号通路。项目的开展不仅可以揭示转录因子NnWRKY70对莲生物碱合成调控的分子机制，而且对于充分利用水生植物莲资源、开发新的荷叶碱高产品种具有重要的现实意义。

荷叶生物碱因其在降“三高”方面的显著功效，一直以来都引人关注。目前对荷叶碱的研究基本集中在化学结构分析、分离纯化以及药理活性分析等，对其在植物莲（Nelumbo nucifera）中的生物合成及其调控机制尤其是转录因子调控方面研究极少，使得培育高荷叶碱新品种的进展十分缓慢。本项目从莲基因组中NnWRKY转录因子家族为出发点，挖掘出65个NnWRKY基因，分布于莲的8条染色体上。大部分NnWRKY基因是成对出现的。与拟南芥分类一致，莲中NnWRKY基因可分为7亚类。共线性分析表明这些成对出现的NnWRKY基因可能是由于全基因组复制事件或者染色体片段复制事件产生。此外，莲NnWRKYs受到SA、JA和淹水处理的显著调控。利用分子生物学手段，本项目对NnWRKY70转录因子进行了功能研究。结果表明，同源基因NnWRKY70a和NnWRKY70b表达量随莲的生长发育而增加，且在莲发育的第七阶段达到最大值。在莲的八种组织（根、根状茎、叶片、花瓣、胚、心皮、叶柄、雄蕊）中发现NnWRKY70a基因在叶片中的表达量最高，而NnWRKY70b基因在根中的表达量最高。通过瞬时转化烟草，荧光显微镜下发现NnWRKY70a和NnWRKY70b转录因子均是核定位蛋白。另外，利用双荧光素酶检测系统发现转录因子NnWRKY70a和NnWRKY70b对荷叶碱合成关键酶TYDC和7OMT基因有一定激活作用。酵母双杂交实验验证了与NnWRKY70b转录因子互作的蛋白有25个。除此以外，转基因以及病原菌实验证实了NnWRKY70a和NnWRKY70b转录因子可能是植物抗莲链格孢真菌的正向调控因子。为了建立细胞培养体系进行生物碱的合成，本项目建立了一套高效的莲愈伤组织诱导体系。研究表明，未成熟子叶和胚外植体能在加入3 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4- d)和0.5 mg/L 6-苄基嘌呤(6-BA)的MS培养基上诱导愈伤组织，且愈伤组织诱导受莲品种、光照条件、外植体发育阶段、取样时间等因素的影响。同时，在莲愈伤组织中检测到少量的莲苄异喹啉生物碱(BIA)的积累以及BIA生物合成基因的表达。本项目的实施不仅揭示了转录因子NnWRKY70对莲生物碱合成调控的分子机制，而且对于充分利用水生植物莲资源、开发新的荷叶碱高产品种具有重要意义。

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