酱油生产过程氨基甲酸乙酯前体物质瓜氨酸的积累与调控机制

Citruline is one of the precursors of ethyl carbamate (EC), which is mainly synthesized by lactic acid bacteria in wine production. However, biosynthesis of citruline during soy sauce fermentation by specific microorganism species is partially clarified and its accumulation as well as regulation mechanisms still need to be disclosed. This proposal targets on isolation and characterization of lactic acid bacteria that are mainly responsible for accumulation of citruline during soy sauce fermentation process. The transcription control and regulation for genes that are involved in arginine deminase (ADI) pathway or other key genes/regulators under stress conditions will be confirmed and discovered by microbial genome transcirptome analysis(i.e. RNA-Seq). Discovery of the rationale of which citruline is biosynthesized and accumulated in soy sauce fermentation processes will help to uncover of the biosynthesis and regulation mechanisms of toxic nitrogenous compound EC in fermented food and brewages. Therefore, this work turns to be the key basis in finding solutions for removal or reduction of EC in fermented food manufacture.

瓜氨酸是酱油中形成氨基甲酸乙酯的前体物质之一。虽然瓜氨酸的合成已被在葡萄酒生产体系中证实为与乳酸菌的代谢有关，但是酱油中与瓜氨酸合成相关的微生物还没有被识别，其在酱油发酵环境下的积累和合成调控机制也不十分清楚。本项目将用前体物质反应动力学分析方法，证实瓜氨酸对酱油中EC形成的贡献和其产生的主要阶段。采用转录组高通量测序分析手段(RNA-Seq)，以分离得到的酱油中与高瓜氨酸合成能力密切相关的关键菌株为研究对象，考察他们在工业环境条件下其精氨酸脱亚氨基酶途径(ADI)各基因表达的调控模式，探索关键微生物瓜氨酸合成与积累的调控机制，对阐明典型发酵食品中氨基甲酸乙酯的积累和调控机制具有重要指导意义；同时也可以为消除和控制发酵食品中由类似微生物代谢调控导致的氨基甲酸乙酯前体物质的积累的研究提供理论依据。

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate, EC)是一种广泛存在于发酵食品和酒精饮料中，由EC前体与乙醇自发反应而形成的2A级致癌物。酱油发酵是一个混菌发酵过程，目前其EC主要前体及形成途径尚未得到解析，也没有有效的EC消除策略。因此，阐明酱油发酵过程中EC前体的生成与微生物代谢途径的关联性，明晰酱油中EC的形成途径，对于控制或减少酱油中EC含量具有重要的意义。本项目主要研究结果如下：.(1) 通过分析化学方法证实了瓜氨酸是酱油中EC的主要前体。揭示了酱油发酵过程瓜氨酸的合成和积累机制：乳酸发酵时期，嗜酸乳酸足球菌在盐胁迫下通过精氨酸脱亚氨酶途径合成和积累瓜氨酸；乙醇发酵时期，以葡萄球菌为主的细菌在乙醇和游离脂肪酸的协同作用下通过精氨酸脱亚氨酶途径合成和积累瓜氨酸；.(2) 采用高通量筛选方法获得了1株利用EC前体且不积累前体的解淀粉芽孢杆菌JY06，在酱油发酵过程中添加该菌，显著减少了瓜氨酸的积累和终产品中EC含量；.(3) 在酱油酿造过程中添加解淀粉芽孢杆菌JY06，工业规模EC及其前体瓜氨酸含量较原有工艺分别降低34%和51%，且对酱油主要理化指标和风味物质未产生影响。.本项目首次系统阐明了酱油发酵过程氨基甲酸乙酯前体瓜氨酸的积累机制。建立的基于酱醪体系自有微生物干预对混菌发酵体系中胺（氨）类危害物含量的控制策略，对于促进生物技术在传统发酵食品中的应用、实现传统发酵食品工业产业升级和可持续发展，具有重大的科学意义和工业应用价值。

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