深海热液噬菌体NrS-1 DNA聚合酶的功能、结构与应用研究

结题报告
项目介绍
AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    31870165
  • 项目类别：
    面上项目
  • 资助金额：
    59.0万
  • 负责人：
    朱斌
  • 依托单位：
    华中科技大学
  • 学科分类：
    C0107.病毒学
  • 结题年份：
    2022
  • 批准年份：
    2018
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2019-01-01 至2022-12-31

项目摘要

In this study we will carry out extensive functional and structural investigation on the recently discovered DNA polymerase from deep-sea vent phage NrS-1, including measurements of its catalytic efficiency, thermostability, accuracy, processivity and fidelity, etc., as well as obtaining and analysis of the structures of its catalytic domain and full-length enzyme in their various catalytic status. The application of NrS-1 DNA polymerase in DNA sequencing and synthesis of modified nucleic acids will be tested and optimized. Considering the unique property of NrS-1 DNA polymerase to synthesize DNA de novo in the absence of any primer, this project will improve the understanding of polymerase evolution and mechanism, and may generate original enzymatic reagents from China.
本项目将对近期发现的深海热液噬菌体NrS-1的DNA聚合酶进行深入的功能和结构研究，测定其催化速率、热稳定性、保真性、延伸性、底物专一性等基本功能特性，获得其催化结构域及全长酶在不同催化状态的晶体结构，在此基础上探索其在DNA测序和修饰核酸合成中的应用。鉴于NrS-1 DNA聚合酶合成DNA无需引物的独特性质，该研究将促进对核酸聚合酶的进化和机制的认识，并可期产出中国原创的核酸工具酶。

结项摘要

引发聚合酶属于真核-古菌引发酶超家族，同时具有引发酶和DNA聚合酶活性。本项目研究目标是课题组原创发现的来自深海病毒NrS-1的代表性引发聚合酶。通过本项目的研究我们解析了NrS-1聚合酶催化结构域的晶体结构并通过详尽的结构与生化研究发现了NrS-1聚合酶多个催化关键位点，其中一个特色环状肽段取代了真核-古菌引发酶超家族保守的锌指结构。在NrS-1聚合酶催化域结构中的一个与引发酶识别位点及起始合成相关的螺旋簇结构域与其它真核-古菌引发酶相应保守结构相比相对灵活，这与酶活性实验中发现的NrS-1聚合酶可识别不同的DNA序列起始合成相一致。本研究的一个重要发现是该螺旋簇结构域的突变虽然降低了NrS-1聚合酶的引发活性，却显著增强了其DNA聚合活性。NrS-1聚合酶引发和聚合两种活性的冲突启示了自然界用两种聚合酶分别执行DNA合成起始及延伸的原因。..同时，在本项目支持下课题组发现了四种新型核酸酶功能并开发了其中三种在RNA体外合成中的应用，包括：.1..GajA DNA内切酶：首次研究存在于自然界8.5%细菌与古菌中的Gabija免疫系统机制并发现其中GajA蛋白质是一个受核苷酸浓度负调控的DNA缺刻内切酶，揭示了一种通过感知核苷酸浓度变化启动防御的精简高效的新型抗病毒机制。.2..T7-S43Y RNA聚合酶：通过定向进化方法和体外酶学研究发现了T7 RNA聚合酶的S43Y突变体，可同时降低转录中断和非特异性末端延伸，极大提高体外RNA合成纯度。.3..KP34 RNA聚合酶： phiKMV类噬菌体中首个被鉴定的单亚基RNA聚合酶，其功能特点是识别两类互不相关的转录启动子，其应用优势在于提高RNA末端精确性提高40倍。.4..VSW-3 RNA聚合酶：来自香格里拉高原冰湖，能够在低至4摄氏度条件下合成RNA，最大优势是不含T7 RNA聚合酶产物中普遍存在的双链RNA（dsRNA）副产物，dsRNA可引发严重的细胞毒性，因此VSW-3 RNA聚合酶对当前热门的mRNA药物、mRNA疫苗等研究与产业意义重大。

项目成果

期刊论文数量（8）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（1）
A nucleotide-sensing endonuclease from the Gabija bacterial defense system.
来自 Gabija 细菌防御系统的核苷酸感应核酸内切酶。
  • DOI：
    10.1093/nar/gkab277
  • 发表时间：
    2021-05-21
  • 期刊：
    Nucleic acids research
  • 影响因子：
    14.9
  • 作者：
    Cheng R;Huang F;Wu H;Lu X;Yan Y;Yu B;Wang X;Zhu B
  • 通讯作者：
    Zhu B
Psychrophilic phage VSW-3 RNA polymerase reduces both terminal and full-length dsRNA byproducts in in vitro transcription.
嗜冷噬菌体 VSW-3 RNA 聚合酶可减少体外转录中的末端和全长 dsRNA 副产物
  • DOI：
    10.1080/15476286.2022.2139113
  • 发表时间：
    2022-01
  • 期刊：
    RNA BIOLOGY
  • 影响因子：
    4.1
  • 作者：
    Xia, Heng;Yu, Bingbing;Jiang, Yixin;Cheng, Rui;Lu, Xueling;Wu, Hui;Zhu, Bin
  • 通讯作者：
    Zhu, Bin
The Cyclic Oligoadenylate Signaling Pathway of Type III CRISPR-Cas Systems.
III 型 CRISPR-Cas 系统的环状寡腺苷酸信号通路
  • DOI：
    10.3389/fmicb.2020.602789
  • 发表时间：
    2020
  • 期刊：
    Frontiers in microbiology
  • 影响因子：
    5.2
  • 作者：
    Huang F;Zhu B
  • 通讯作者：
    Zhu B
DOCK2 regulates antifungal immunity by regulating RAC GTPase activity.
DOCK2通过调节RAC GTPase活性来调节抗真菌免疫
  • DOI：
    10.1038/s41423-021-00835-0
  • 发表时间：
    2022-05
  • 期刊：
    Cellular & molecular immunology
  • 影响因子：
    24.1
  • 作者：
    Ma X;Tan X;Yu B;Sun W;Wang H;Hu H;Du Y;He R;Gao R;Peng Q;Cui Z;Pan T;Feng X;Wang J;Xu C;Zhu B;Liu W;Wang C
  • 通讯作者：
    Wang C
Molecular Dissection of the Primase and Polymerase Activities of Deep-Sea Phage NrS-1 Primase-Polymerase.
深海噬菌体 NrS-1 引物酶-聚合酶引物酶和聚合酶活性的分子解剖
  • DOI：
    10.3389/fmicb.2021.766612
  • 发表时间：
    2021
  • 期刊：
    Frontiers in microbiology
  • 影响因子：
    5.2
  • 作者：
    Huang F;Lu X;Yu C;Sliz P;Wang L;Zhu B
  • 通讯作者：
    Zhu B

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PSP:一种高效的偏序域上skyline查询处理方法
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  • 作者：
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  • 通讯作者：
    李冠宇
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  • 发表时间：
    --
  • 期刊：
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  • 作者：
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  • 通讯作者：
    朱斌
N型圆钢管相贯节点力学性能的试验研究
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  • 期刊：
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  • 通讯作者：
    李自林
超高效液相色谱高分辨质谱法测定水体中青霉素残留
  • DOI：
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  • 发表时间：
    2020
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    王建国
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  • 发表时间：
    --
  • 期刊：
    岩土工程学报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    朱瑞燕;朱斌;陈仁朋;罗军;孔令刚
  • 通讯作者：
    孔令刚

其他文献

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朱斌的其他基金

RNA-PCR技术
  • 批准号：
    32150009
  • 批准年份：
    2021
  • 资助金额：
    300 万元
  • 项目类别：
    国际(地区)合作与交流项目
新颖噬菌体转录体系的解析及应用
  • 批准号：
    31670175
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  • 项目类别：
    面上项目

相似国自然基金

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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