弱激光疗法对高糖诱导的成纤维细胞线粒体氧化应激损伤的修复作用

Fibroblasts are important effector cells in high glucose induced skin lesions, which may be caused by oxidative stress injury induced by high glucose. At present, most of the methods used to treat this kind of injury are single factor and single target therapy, such as cytokines or antioxidants. Low level laser therapy (LLLT) can activate the mitochondrial respiratory chain to induce cell proliferation and induce signal cascade. We hypothesized that LLLT could repair the oxidative stress injury induced by high glucose by increasing cell antioxidant activity. In this study, we proposed a dual-wavelength LLLT on fibroblasts in high glucose environment by detecting the production of ROS, antioxidant enzyme (CAT, SOD and tGPx), MMPs expression, collagen protein, cytokines, transcription factor, mitochondrial ultrastructure and mitochondrial membrane potential. The aim of this study was to explore the regulation of LLLT on cell response to mitochondrial oxidative stress and the balance of MMPs/TIMPs and optimizing the biological effects of laser by revealing the wavelength and light energy of high glucose in the cellular and molecular level. This study provides a new method for LLLT to accelerate wound healing in high glucose environment, and provides a solution to the problem of difficult healing of diabetic patients.

成纤维细胞是高糖环境诱导皮肤病变过程中重要的效应细胞，这种病变可能是由高糖诱导的氧化应激损伤产生。目前用于治疗这种损伤的方法多为细胞因子或者抗氧化剂等单分子单靶点治疗，效果有限。弱激光疗法(LLLT)能通过活化线粒体呼吸链来引发细胞增殖和诱导信号级联效应，改善细胞氧化损伤。我们推测，LLLT能通过提高细胞抗氧化性来修复高糖环境诱导的氧化应激损伤。本研究拟用不同波长弱激光照射高糖环境下人皮肤成纤维细胞，通过检测细胞产生ROS、抗氧化物酶(CAT、SOD和tGPx)、MMPs水平、胶原蛋白、炎性因子、转录因子、线粒体超微结构和膜电位等，从分子和细胞水平进行研究，探索高糖环境下LLLT对线粒体氧化应激以及MMPs/TIMPs平衡的调控作用；揭示高糖环境下波长和光照能量优化LLLT生物效应的规律。为建立LLLT加速高糖环境下伤口愈合的治疗方案奠定基础，提供解决临床糖尿病患者创伤难以愈合问题的思路。

成纤维细胞是高糖环境诱导皮肤病变过程中重要的效应细胞，这种病变与高糖诱导的氧化应激损伤密切相关。目前用于治疗这种损伤的方法多为细胞因子或者抗氧化剂等单分子单靶点治疗，效果有限。弱激光疗法(LLLT)能通过活化线粒体呼吸链来引发细胞增殖和诱导信号级联效应，改善细胞氧化损伤。我们推测，LLLT能通过提高细胞抗氧化性来修复高糖环境诱导的氧化应激损伤。该研究采用单、双波长(635、808和635/808 nm，0-40 mW/cm2, 0-24 J/cm2)弱激光照射高糖环境下人皮肤成纤维细胞，从分子和细胞水平进行研究。在细胞生长方面，通过MMT检测细胞增殖活性，选定30 mM的葡萄糖浓度作为高糖模型。在细胞活力方面，从细胞增殖、旁分泌细胞因子(FGF、NGF、IGF、TGF、TNF-α和IL-1β等)、转录因子(NF-κB)、活性氧(ROS)、抗氧化酶活性(CAT、SOD、tGPx)、脂质氧化能力(MDA)、过氧化氢酶（CAT）等方向进行细胞分子生物学研究，结果表明LLLT促进成纤维细胞的增殖，改善高糖环境对细胞增殖的抑制作用，刺激细胞因子的分泌增加细胞内ROS的产生，增强抗氧化酶的活性。在基质金属蛋白酶及其抑制剂(MMPs/TIMPs)调控方面，研究发现高糖上调了 MMPs的表达，下调了TIMPs的表达，LLLT扭转了MMPs/TIMPs表达失衡，减缓了MMPs对细胞外基质的进一步水解，有利于创面愈合和恢复。在线粒体功能方面，高糖环境增加线粒体通透性，降低线粒体膜电位(∆ψm)及活性，并诱导细胞凋亡。弱激光照射后，∆ψm升高，凋亡明显减少。本项目通过以上四方面阐述双波长弱激光对高糖环境诱导氧化应激损伤的调控作用以及高糖诱导氧化应激下细胞线粒体功能的影响，为治疗高糖环境引起的皮肤创伤延迟提供理论支持，提供解决临床糖尿病患者创伤难以愈合问题的思路。

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