单颗粒水平研究乙脑病毒入侵细胞的动态过程及机制

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
31000089
项目类别：
青年科学基金项目
资助金额：
20.0万
负责人：
王薇
依托单位：
中国科学院武汉病毒研究所
学科分类：
C0107.病毒学
结题年份：
2013
批准年份：
2010
项目状态：
已结题
起止时间：
2011-01-01 至2013-12-31

项目参与者：
金卉；罗侃；金锐；柴凡；
关键词：
单颗粒示踪内吞网格蛋白脂筏乙型脑炎病毒

项目摘要

乙型脑炎病毒（JEV）引发的乙型脑炎是严重危害我国人民健康的重要病原体之一，患者中约25%-30% 死亡，50% 导致永久性中枢神经系统后遗症。明确JEV的入侵机制是设计新型抗病毒药物的基础。以往对病毒入侵途径的研究多采用分析感染细胞的裂解物或检测固定细胞样本中病毒的方法，不能"高保真"地分析JEV感染的动态过程。我们利用荧光标记动态成像技术，在单颗粒水平对病毒侵染细胞的过程，即从吸附、穿入经早期内涵体、晚期内涵体直至自噬溶酶体的途径进行"实时"分析。重点考察病毒在细胞膜表面运动的方向、与细胞膜碰撞的频率；与细胞膜转运蛋白如网格蛋白等的共定位；在胞内囊泡运输的轨迹、速率以及膜融合和脱衣壳等关键步骤发生的时机、强度。结合生物化学、免疫学和电镜等手段，阐明JEV入侵细胞的动态过程及机制。为设计干预乙脑病毒入侵的新型药物提供理论参考，为探索其它病毒入侵机制提供借鉴。

结项摘要

本项目遵照申请书中所述主要研究计划要点进行，用多色荧光标记病毒和细胞的不同组分，在单病毒颗粒水平对病毒侵染细胞的过程进行实时动态考察，在此基础上，结合RNA干扰实验、药物抑制实验以及电镜等方法明确阐述乙型脑炎病毒（JEV）进入细胞的途径。.首先，利用亲脂性荧光染料成功标记病毒囊膜，用荧光蛋白融合质粒或荧光染料标记细胞膜、内体、骨架、内质网等细胞器。考察JEV进入后在细胞中的运动轨迹及其与细胞骨架、内吞囊泡的共定位情况，实现了荧光标记病毒与宿主细胞各种内吞结构动态相互作用的实时观测。证实JEV的入侵机制是细胞骨架依赖以及低 pH 依赖的。JEV内吞进入细胞后，需要经过内体途径运输到晚期内体之后才能与内体膜发生融合，释放基因组到细胞质中开始复制。其次，用小分子药物、负显性突变体和RNA干扰等实验，证实JEV在神经瘤母细胞中既不通过网格蛋白、小窝蛋白介导，也不通过巨胞饮途径进入细胞。同时发现细胞膜上的胆固醇在病毒入侵中发挥重要作用，细胞内胆固醇含量随病毒感染时间的延长而逐步下降，利用药物抑制细胞内胆固醇合成或直接去除细胞膜上的胆固醇都能有效抑制病毒感染，回补胆固醇能拮抗药物的抗病毒能力。接下来，考察细胞自噬对JEV感染的影响，发现JEV 能够引发LC3-II的聚集并引起自噬潮，而完全自噬的发生能促进病毒基因组的复制，敲掉自噬相关基因抑制自噬的发生则会抑制病毒基因组在细胞内的复制。证实自噬的发生对病毒基因组的复制是不可或缺的，其作用机制是通过负调控干扰素的表达从而促进病毒基因组的复制。最后，利用噬菌体展示技术，通过对固相化的JEV E蛋白domain Ⅲ进行多轮亲和筛选，获得与之特异性结合的多肽，其中多肽P3与domain Ⅲ的结合力达到微摩尔级别，在体外能有效阻止病毒与细胞的吸附，抑制病毒感染。.上述研究内容对设计干预乙脑病毒入侵的新型药物提供了理论参考，为探索其它病毒入侵机制提供借鉴。相关研究成果发表在PLoS ONE（2013）、Antiviral Research（2014）等主流学术期刊，并于Gordon Research Conferences (GRC)主办的“Infections of the Nervous System”会议上做大会报告和墙报报告。项目负责人在本课题支持下，在乙脑病毒的入侵机制等方面开展了富有特色的工作，评聘为副教授/硕士生导师。