相分离方法制备双功能型MONOLITH材料及其作为蛋白质药物高效分离、纯化和定点修饰通用性平台的构建

The purpose of this project is to develop a novel type of bifunctional cellulose monolith as a common platform, which can be utilized to improve the low efficiency, high complexity and high cost in the process for protein purification as well as the short half-life, poor stability and strong immunogenicity of protein drugs. In this project, the cellulose monolith is prepared by the thermally induced phase separation of cellulose acetate and its subsequent alkaline hydrolysis. After chemical modifications, cellulose monolith is bifunctionalized through chelating metal nickel ions and immobilizing transglutaminase successively. Protein drugs are selectively adsorbed through the affinity interaction between nickel ions and histidine-tags and then modified by polyethylene glycol site-specifically with the mediating of transglutaminase. Through this platform with the hierarchically porous morphology and bifunctionalized surface, the fabrication of long-acting protein drugs with high purity can be achieved efficiently. In addition, due to the easy controllability of the internal morphology and the diversity of surface modification derived from phase separation method, cellulose monolith can be used as a common platform technology with great application potential for the protein drugs.

针对目前重组蛋白质药物分离提纯效率低且成本高以及蛋白质分子半衰期短和免疫原性高等亟待解决的问题，本项目制备了一种新型的双功能型纤维素MONOLITH材料作为对蛋白质药物进行分离、提纯和定点修饰进行同步操作的平台。本项目创新性地利用热引发相分离和后期水解相结合的方法得到具有多层次三维贯通孔洞结构的纤维素MONOLITH材料。经过化学修饰之后再对其表面进行分步双功能化，可同时螯合镍离子和固定化谷氨酰胺转移酶：前者与组氨酸标签之间的亲和作用可对蛋白质药物进行选择性吸附；后者可介导蛋白质药物的定点聚乙二醇化修饰。本项目采用相分离技术赋予了纤维素MONOLITH可控的内部多层次孔洞结构和多样化的表面修饰性，使其作为一个高效率、高通量制备高纯度长效蛋白质药物的通用性平台，有着巨大的发展前景和应用潜力。

重组蛋白质药物有着活性高、作用位点专一、毒副作用小和生物功能明确的特点，在严重危及人体生命安全的疾病治疗方面发挥着重要的作用。但目前重组蛋白质药物面临着诸多问题，首先是制备过程的分离提纯步骤效率低、过程复杂且成本高。另外，蛋白质大部分分子量相对较小，易被酶水解和肾消除，必须频繁给药才能维持有效的血药浓度。同时，蛋白质的稳定性差、免疫原性高和水溶性低，也严重限制了其在临床上的进一步应用。. 为解决这些问题，本项目构建了一种串联型双功能化MONOLITH平台材料来实现重组蛋白质药物高效分离提纯以及定点聚乙二醇（PEG）长效化修饰。首先采用热引发相分离和碱性水解相结合的方法得到一种具有多层次孔洞结构的纤维素CE MONOLITH；然后通过CE MONOLITH与酸酐类化合物的反应引入配体基团，以固定柱流通的方式螯合吸附上金属离子后构建了一个基于MONOLITH材料的新型亲和色谱固定相Ni2+-CE MONOLITH。接着，以CE MONOLITH作为载体，对其进行表面修饰后对微生物来源的谷氨酰胺转氨酶（MTGase酶）进行固定，得到的MTGase-CE MONOLITH可以方便高效地催化蛋白质药物的定点修饰，并具备优良的重复再利用性。最后，选用Ni2+-CE MONOLITH和MTGase-CE MONOLITH作为串联型双功能化MONOLITH平台材料，实现了对E.coli裂解液中干扰素IFN α-2b的分离提纯和PEG的定点单修饰。. 本项目选用了天然高分子纤维素作为MONOLITH的原料，具有高亲水性和高化学稳定性，避免了合成高分子非特异性吸附高和琼脂糖化学稳定性低的问题；在制备过程中使用的相分离的方法使得到的MONOLITH材料具备多层次孔洞结构用以高效实现高纯度长效蛋白质药物的制备；选用固定化MTGase酶对蛋白质进行定点修饰，避免了随机修饰带来的蛋白质活性下降，且固定化酶的高重复利用性可极大降低长效化蛋白质药物的生产成本。因此，本项目首次成功构建了一种串联型双功能化MONOLITH作为实现重组蛋白质药物高效提纯和定点修饰的通用性平台材料，在制备定点PEG修饰的长效化蛋白质药物领域有着广泛的应用前景和重要的意义。

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