iTRAQ-LC-MS/MS定量蛋白质组学筛选亲神经亚型梅毒螺旋体标志物及其应用价值评估

Neurosyphilis is lack of sensitivity and specificity in diagnosis. So its misdiagnosing rate is very high. Our previous studies showed that molecular typing of the treponema pallidum (Tp) can help the neurosyphilis diagnosis. However, the nucleic acid extraction rate of the syphilis clinicals sample is quite low, which limits the clinical application of genetyping. Fortunately, our further researches indicated that there were different proteins expressed in neurotropic subtype Tp and non-neurotropic subtype Tp by two-dimensional electrophoresis, which suggested that proteomics approach is an available way to find a protein biomarker for neurosyphilis diagnosis. In this study, we will use iTRAQ-LC-MS/MS methodology to screen a specific candidate protein biomarker of the neurotropic Tp subtype; will use western blotting to verify whether the candidate protein is expressed differentially in peripheral blood of the neurosyphilis and non-neurosyphilis patients; further evaluate the cross antigenicity of the candidate protein biomarker; make a comprehensive evaluation to find out a potential serum biomarker for neurosyphilis diagnosis (maybe more than one); chemiluminescence immunoassay should be established to detect the serum peotein biomarker, and further evaluating its value for using as a index of neurosyphilis diagnosis, high-risks group screening and indicator of lumbar puncture. This studies, from the perspective of a our previous research in genetyping, looking for a potential serological biomarker for neurosyphilis diagnosis, are expected to find out a novel criteria for neurosyphilis diagnosis and indicator for lumbar puncture, which have puzzled the clinicians for a long time.

神经梅毒诊断缺乏灵敏、特异的指标，误诊率高。我们前期研究表明：梅毒螺旋体（Tp）基因分型有助于神经梅毒诊断，但临床标本的DNA提取率极低，不适合临床应用；而不同亚型Tp双向电泳蛋白表达谱存在质和量的不同，提示可通过蛋白质组学方法筛选神经梅毒标志物。本项目拟采用iTRAQ-LC-MS/MS定量蛋白质组学方法高通量筛选亲神经亚型Tp菌株候选差异蛋白标志物；采用Western blot方法验证候选蛋白在神经梅毒和非神经梅毒患者外周血中的表达；鉴定差异蛋白的交叉抗原性；综合评价，获得潜在的、可用于神经梅毒诊断的血清标志物（可能不止1个）；建立化学发光免疫分析法检测血清蛋白标志物，评估其作为神经梅毒诊断、高危人群筛选、及腰穿指标的价值。本项目研究从已知Tp基因亚型入手，寻找血清中可用于神经梅毒诊断的标志物，有望解决神经梅毒诊断和腰穿指标这一长期困扰临床医生的难题。

近年来，梅毒的流行导致神经梅毒发病率增高。神经梅毒临床表现与其它神经系统性疾病极为相似（被称为“伟大的魔术师”），且缺乏灵敏性特异性的实验室指标，因此其误诊率极高。一直以来，神经梅毒的诊断一直是困扰临床医生、医学检验人员的重大难题，是当前梅毒研究的难点和盲区。值得庆幸的是，我们课题组发现了亲神经梅毒亚型Tp株的存在，其与神经梅毒的发生密切相关，并建立基因分型方法，用于特异性区分亲神经亚型Tp和非亲神经亚型Tp株。这一研究不仅为神经梅毒的诊断提供了一个新的指标，而且对梅毒鉴别复发与再感染等都有重大意义。然而，从患者标本提取足够量的DNA用于梅毒基因分型，然后用于临床诊断在大多数患者中是很难做到的，因此，迫切需要寻找一个比基因分型更加简便快速的方式对神经梅毒进行诊断。本研究中，我们首先采用了iTRAQ-LC-MS/MS定量蛋白质组学方法，初步筛选得到亲神经亚型Tp菌株差异蛋白标志物；再采用Western blot方法验证候选蛋白在神经梅毒和非神经梅毒患者外周血中的表达；综合评价，获得潜在的、可用于神经梅毒诊断的血清标志物，并构建化学发光免疫分析法检测该标志物，评估其作为神经梅毒诊断、高危人群筛选、及腰穿指标的价值。我们的结果发现，iTRAQ-LC-MS/MS方法学初步筛选发现了20个蛋白在亲神经梅毒亚型株中高表达，随后采用RT-PCR和Western blot验证得到了3个（TP0163、TP0956、TpN33）在亲神经梅毒亚型Tp菌株及神经梅毒患者血清中高表达的蛋白。综合分析，最后选取TP0163和TP0956两个蛋白建立化学发光免疫分析法（NS-CIA），分别检测该蛋白在不同患者血清中的表达水平。分析标志物的检测结果与脑脊液指标（如CSF蛋白、白细胞数和梅毒血清学抗体等指标）进行相关性分析，发现新构建方法的神经梅毒判断的的灵敏度为55.26%，特异性为66.13%，对神经梅毒的诊断及腰穿指针的选择具有一定的临床应用价值。此外，在实验过程中我们对神经梅毒患者血清中TPPA滴度变化与神经梅毒诊断以及转归进行了相关性分析，发现血清TPPA不仅可作为神经梅毒的筛查指标（筛查能力优于血清RPR滴度），而且与神经梅毒的转归密切相关，颠覆了传统的“梅毒特异性抗体不能用于疗效监测” 观点。

内容获取失败，请点击重试