以结核分枝杆菌细胞壁合成酶RmlB和RmlC为靶点的双靶点抗结核药物的虚拟筛选和先导化合物发现

The cell wall of mycobacterium tuberculosis is a valid target for anti-mycobacterials. RmlB and RmlC paly important roles in the biosynthesis of cell wall by involving the synthesis of rhamnose. Mycobacterium tuberculosis can be inhibited by inhibiting the activities of RmlB and RmlC. In this study, we attempt to establish a virtual screening system to identify potent dual-target inhibitors targeting RmlB and RmlC by screening compound databases. Mycobacterium smegmatis is a non-pathogenic "fast grower" microorganism, which shares the same unusual cell wall structure of M. tuberculosis. We established a simple fast screening model by using mycobacterium smegmatis. We expressed RmlB and RmlC proteins using Escherichia coli, and established a high-through screening model based on the active proteins. The potent inhibitors will be tested by using the two level test methods, and the positive compounds will be tested their anti-mycobacterium activity.

结核分枝杆菌细胞壁已被证实是研发抗结核分枝杆菌药物的重要靶标。RmlB和RmlC通过参与dTDP-鼠李糖的合成在结核杆菌细胞壁的生物合成中发挥重要作用，抑制RmlB和RmlC活性可破坏结核分枝杆菌细胞壁形成，达到抑菌和杀菌目的。本研究拟利用计算机辅助药物分子设计技术构建以RmlB和RmlC为靶点的双靶点抑制剂虚拟筛选体系，筛选化合物数据库，得到具有潜在活性的候选化合物库。以与结核分枝杆菌具有相同细胞壁结构的耻垢分枝杆菌作为检定菌，对候选化合物库进行初筛，得到初筛阳性化合物。利用原核表达体系克隆表达结核分枝杆菌RmlB和RmlC，并分离纯化RmlB和RmlC蛋白，建立酶水平的高通量药物筛选模型。利用酶水平筛选模型进行复筛，复筛阳性化合物进行细胞毒性和抗结核分枝杆菌活性检测，以期得到低毒性高抗菌活性的双靶点抑制剂。项目的实施可为研发抗结核尤其是抗耐多药结核药物提供更多的候选化合物。

成功构建靶向RmlB和RmlC的双靶点抗结核小分子化合物的虚拟筛选平台。利用该平台对百灵威提供的大型虚拟化合物数据库进行筛选，选中排名前150的化合物进行抗耻垢分枝杆菌的活性检测，遗憾的是并没有发现具有显著抑制效果的化合物。分析原因分析原因可能是满足此虚拟筛选流程的化合物数目较低且结构较为单一，要想筛选到满足条件的活性化合物，需要筛选更大的数据库，比如pubchem数据库。鉴于计算机的计算能力和经费支付能力，我们暂停该课题的研究。接下来，我们选择了另外一个对结核分枝杆菌生存至关重要的酶，二氢叶酸还原酶(mtDHFR)，作为抗结核先导化合物发现的靶点。. 结核分枝杆菌新抑制剂的开发对治疗感染结核的病人是非常重要的。结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶(mtDHFR) 在叶酸代谢途径中是一种关键的酶，其对RNA、DNA和蛋白质的生物合成是必需的。因此，该酶是药物化学的重要靶点。本研究的目的是通过虚拟筛选和体外活性验证发现新型mtDHFR抑制剂。在本研究中，首先建立mtDHFR抑制剂的通用药效模型，然后是通过一个大的测试数据集对药效团模型进行验证。利用构建的药效模型进行虚拟筛选；选择了331个化合物并对接到DHFR的活性位点，最后根据对接得分和判断这些化合物是否与活性位点有着重要的相互作用选择了131个化合物。首先对这些化合物进行抑制耻垢分枝杆菌mc2155的活性测试，发现有四种具有新型骨架的活性化合物，然后对者四种活性化合物进行抗结核分枝杆菌H37Rv的活性检测；活性最高的化合物6-(4-(3,5-二甲基苄基-2-基) -1-酰基吡啶-2,4-二胺(在本文中称为G3)的MIC值为4.735 μg/ml，对分枝杆菌有很强的杀菌活性。体外酶试验结果表明，该化合物是一种DHFR抑制剂，但缺乏显著的选择性。体外细胞毒性试验表明，化合物G3 在10μg /ml的浓度下，对正常肝细胞株HL7702只有轻微的抑制作用。所有的结果表明，活性最高的化合物G3具有良好的潜力，可作为先导化合物进一步开发。

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