基于LAMP纸芯片即时检测骨髓增殖性肿瘤分子标志物谱的研究

Classical myeloproliferative neoplasms (MPNs), including polycythemia vera, essential thrombocythemia, and primary myelofibrosis, are a subclass of hematological malignancies featured with clonally proliferated blood cells. These diseases may evolve into severe anemia, leukemia transformation and so on. Thrombosis is the most common complication and the major cause of death. JAK2 V617F, MPL W515L/K and CALR mutation type I and II are currently identified as the golden standard genetic markers for MPNs diagnosis. Development of a genetic test system for instant detection of these mutations will facilitate the diagnosis and prognostic evaluation of MPN, besides, contribute to the improved management of MPN induced stroke. However, the current detection method is required to rely on specific equipment and personnel. The POCT of multiple biomarkers cannot be achieved. In this study, we will innovate a paper phase microfluidic chip employing loop-mediated isothermal amplification technology for MPN related genetic variant detection. This chip, as a technical improvement of our previously published PDMS microchip, will incorporate the whole set of peripheral blood DNA isolation, gene amplification, and result in visual interpretation. The goal of this study is to achieve a point of care testing platform for simultaneous analysis of major genetic alterations in MPN. This sample-to-answer method not only reshapes the diagnostic pathway of MPNs, but also providers with a robust tool for MPN-induced stroke screening.

经典的骨髓增殖性肿瘤（MPN）是一组以一系或多系成熟血细胞扩增为特征的克隆性疾病，包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化，可造成严重贫血、急性白血病转化等，血栓是最常见的并发症，也是MPN患者的主要致死原因。JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I型/II型基因突变已经成为诊断MPN的重要分子标志物，检测这三种突变对明确MPN 的诊断、预后，尤其对合并脑卒中的MPN患者的防治具有重要意义。但目前的检测方法均需依赖特定设备和人员，无法做到多个指标的床边检测。前期我们采用螺丝微阀技术制作了检测JAK2 V617F 的PDMS芯片，在此技术上本项目以纸为材料制作一款微流控芯片，整合LAMP 技术在此芯片上完成全血基因组DNA提取、基因扩增及结果可视化判读，实现这三种突变的快速测定，为MPN的分子诊断提供新方法，也为脑卒中患者提供MPN基因筛查手段。

经典的骨髓增殖性肿瘤是一组以一系或多系成熟血细胞扩增为特征的克隆性疾病，包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化，可造成严重贫血、急性白血病转化等。血栓是最常见的并发症，也是MPN患者的主要致死原因。MPN分子标志物JAK2 V617F、 MPL W515L/K and CALR-1/2的检测对于明确MPN的诊断、治疗及预后，尤其对合并脑卒中的MPN患者的防治具有重要意义，但目前的检测方法均需依赖特定设备和人员，无法做到多个指标的即时检测。本研究拟将环介导等温扩增与微流控芯片技术相结合，实现对致病基因突变的快速即时检测，为MPN的分子诊断提供新方法，也为脑卒中患者提供MPN分子标志物的筛查手段。本项目建立了MPN分子标志物谱的微流控检测平台和实时PCR平台，所建立的LAMP方法具有高度的灵敏性和特异性，检测下限可达1%水平，可与经典的实时PCR法相媲美，但本研究中所建立的LAMP法具有以下独特优势：（1）无需荧光标记的探针，因此检测成本更低；（2）检测过程无需变温，因此检测速度更快（30-60min）；（3）微流控芯片是一个通用平台，具有集成化优势，可以再同一条件下、同步完成多样本和多指标的快速检测，为MPN的早期快速诊断提供了良好的技术保障。（4）而且LAMP法可以实现目视化检测，无需复杂的辅助设备，对实验室硬件和操作人员水平的要求更低。本研究所开发的新产品，代表了肿瘤分子诊断的快速检测方向。实现规模化生产之后，将可部分代替目前的生物分子基因检测，节约成本。本项目具有完整的自主知识产权，有较好的成果转化前景。未来的便携式LAMP-Microchip有望实现MPN患者的早期诊断，可更好服务于临床与患者，产生良好的社会效益。

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