基于阴离子交换色谱分级和功能化氧化石墨烯材料富集的N-磷酸化蛋白质组样品预处理新方法研究

Protein N-phosphorylation regulates a series of essential functions in life processes, such as nucleosome assembly, cell transcription, signal transduction and so forth. However, traditional methods are difficult to enrich N-phosphopeptides because of its acid-lability, which leads to current international research on N-phosphoproteomics in its infancy. To better understand the roles of N-phosphorylated proteins in life processes, it is urgent to develop new methods for N-phosphoproteome sample pretreatment. The project intends to develop new technologies including O-phosphopeptide dephosphorylation, anion exchange chromatography fractionation and functionalized graphene oxide enrichment, and establish a universal, high selectivity and high efficiency approach for N-phosphoproteome sample pretreatment by integrating the above technologies, which will provide important technical support for promoting the process of N-phosphoproteome research.

蛋白质的N-磷酸化修饰在核小体组装、细胞转录、信号转导等生命过程中发挥了举足轻重的作用。然而由于N-磷酸化肽段对酸敏感，因此采用传统方法难以富集，进而导致了目前国际上对N-磷酸化蛋白组学的研究尚处于起步阶段。为深入了解N-磷酸化蛋白质在生命过程中发挥的作用，亟需发展N-磷酸化蛋白质组样品预处理新方法。本项目拟发展O-磷酸化肽去磷酸化、阴离子交换色谱分级和功能化氧化石墨烯材料富集等新技术，并通过上述技术的集成，建立具有普适性的、高选择性和高效的N-磷酸化蛋白质组样品预处理新方法，为推动N-磷酸化蛋白组的研究进程提供重要的技术支撑。

发生在组氨酸、赖氨酸、精氨酸侧链氨基的磷酸化修饰，称为N-磷酸化修饰。研究表明N-磷酸化修饰在核心生命活动过程中起到重要作用。由于P-N酰胺键对酸敏感，传统富集方法所需强酸条件易导致P-N键水解。本项目以发展高效的N-磷酸化修饰富集方法为研究目标，发展了多种新型富集材料和新方法用于N-磷酸化修饰富集，以促进N-磷酸化蛋白质组学发展。具体研究内容如下：.1. 以双二甲基吡啶胺双锌离子为磷酸根识别基团，以单分散亚二微米核壳微硅球作为固载基质，制备了新型的双二甲基吡啶胺双锌离子功能化亚二微米核壳微球。功能材料成功用于中性条件下快速富集N-磷酸化肽段；得益于单分散介孔性质，on-tip富集的回收率比自由溶液富集提高4倍。在大肠杆菌酶解产物中鉴定到32个N-磷酸化位点，对应于40个蛋白质，其中5个蛋白质具有激酶性质。研究表明富集作用力包括配位作用、静电作用和亲水相互作用。该研究开创了功能材料用于N-磷酸化修饰富集研究的先河。.2. 利用双二甲基吡啶胺双锌离子与氧化石墨烯表面的π-π堆积作用，制备双二甲基吡啶胺双锌离子功能化氧化石墨烯材料，功能材料具有固载量高、层状结构、分散性好、非特异性吸收少的特点，成功用于中性条件下N-磷酸化蛋白质快速富集。在100倍非磷酸化蛋白质干扰下，材料对N-磷酸化蛋白质的富集因子高到137.9。.3. 发展双二甲基吡啶胺双锌离子功能材料富集结合β-消除的富集策略，减少O-磷酸化肽段对N磷酸化修饰鉴定的干扰，提高N-磷酸化肽段鉴定效率和数目。研究表明经过消除β-消除后10条N-磷酸化肽段平均质谱离子得分从32.9提高到45.4。 .4. 利用二甲基化标记和对角线色谱分离的原理，在赖氨酸磷酸化位点标记轻重二甲基化标记，利用标记和色谱保留时间差异，发展了新型的赖氨酸磷酸化位点鉴定新方法。在100000倍非磷酸化肽段干扰下，实现了赖氨酸磷酸化选择性富集。更重要的是实现了真核生物赖氨酸磷酸化鉴定，共鉴定112个赖氨酸磷酸化位点，实现色谱分离用于真核生物赖氨酸磷酸化富集分离研究。.

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