复合抑制剂耐受酵母的环形染色体基因拷贝数变异热点检测研究

Genomic copy number variation (CNV) affects the biological phenotypes, and telomeres are hotspots of CNV. The precise detection of gene copy number is disturbed by homologous genes and single nucleotide polymorphisms (SNP) in genome sequencing. I synthesized a ring yeast chromosome V, without telomeres, and revealed copy number increases during chromosome rearrangement. I’m applying to detect CNV hotspots of ring chromosomes with the following works. 1) Construct both ring synthetic chromosome V and ring chromosome X by CRISPR and generate yeast strain libraries with chromosome variations. 2) Pick 100 candidates with growth fitness in 50% FAP (furfural, acetic acid and phenol) concentrations for genome sequencing. 3) Establish copy number identify strategy by unique nucleotides, accurately determine copy numbers of each gene, and verify the hotspots and conservative CNVs. 4) Confirm the CNVs by analyzing sequencing reads with loxPsym sites and using real-time quantitative PCR (RT-PCR). 5) Rebuild selected CNVs in wild-type cells by using CRIPSR and DNA assembly strategies, verifying their functional effects to the tolerance of combined-inhibitors. This project will provide new knowledge for eukaryotic CNV detection and biological function effect study.

基因组拷贝数变异影响生物表型，端粒是拷贝数变异产生的热点区域。序列同源性基因和基因组测序的单核苷酸多态性影响基因拷贝数精确检测。申请人化学合成了环形V号酿酒酵母染色体，删除了端粒，证实化学诱导产生基因拷贝数增加。申请人拟开展环形染色体基因拷贝数变异热点检测研究。开展如下工作：1、利用基因编辑工具，构建合成型环形V号和X号染色体，化学诱导获得染色体变异酵母菌株文库；2、选取100株耐受50%浓度复合抑制剂的菌株进行高通量基因组测序；3、建立特异性核苷酸标记的基因拷贝数检测方法，精确测定各基因的拷贝数，统计变异热点和保守性变异，筛选潜在功能性变异；4、基于loxPsym位点测序读长和实时定量PCR等验证拷贝数变异；5、利用基因编辑和DNA组装技术在野生型酵母中重塑拷贝数变异，验证对复合抑制剂耐受的作用。该研究将为真核生物拷贝数变异检测和生物学功能研究提供新知识。

生物体通过产生染色体结构变异驱动生物表型快速进化，应对生长环境压力的胁迫；解析染色体重排规律是挖掘功能性结构变异靶点的关键。本项目围绕“合成型酵母染色体DNA序列、结构与功能的关系”关键科学问题，以化学合成的酿酒酵母环形染色体为对象，从染色体结构变异驱动菌株抑制剂耐受性提升的角度开展研究，快速构建耐受性提升的酵母菌株，探索染色体重排规律，获得抑制剂耐受性基因组新靶点，解析调控机制，建立染色体结构变异与细胞生物学功能进化关系的新策略。主要包括：1）构建含有不同数量环形合成型染色体的酿酒酵母菌株，人工诱导染色体重排，快速创建可耐受高浓度木质纤维素水解液抑制剂的酵母菌株文库；2）建立重排染色体比较基因组学分析方法，研究抑制剂耐受性酵母染色体重排规律，解析拷贝数变异与结构变异热点区域；3）人工重塑酵母染色体结构变异，挖掘功能性结构新变异和新靶点，探索结构变异对耐受性表型提升的调控机制。本项目研究成果将为研究环形染色体重排变异规律提供新知识，为有目标的设计和构建纤维素乙醇高产酵母细胞工厂提供新策略。

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