新的扩张型心肌病分子遗传标志物磷酸酶2A调节亚单位的发现和功能验证

Coronary heart disease, high blood pressure, and cardiomyopathy are the three basic diseases leading to heart failure (HF). Since the pathogenesis of dilated cardiomyopathy (DCM) is not well understood, specific treatments are lack, and the prognosis is poor. Genetic factors are the main causes of DCM, and known candidate genes only can explain 50% of the patients with hereditary DCM. In prior study, we collected 1 DCM family and discovered a new candidate gene: protein phosphatase 2 a (PP2A) regulatory subunit. Based on the reported functions of PP2A and regulatory subunit family members in DCM and HF, we hypothesized that the PP2A regulatory subunit is the causative gene for DCM. For further confirmation and clarification of the pathogenic role of PP2A regulatory subunit mutation, we propose to: (1) screen new mutations in PP2A regulatory subunit in more cases; (2) identify the characterization of the zebrafish disease model: rescue experiments, the macroscopic and microscopic structures observation of the heart, cardiac function tests; (3) transfect muscle cell lines with mutant and wild type plasmids and compare the effects on the muscle cells; (4) analyze the gene expression profile of the knockout zebrafish, and predict the disease pathway; (5) find the target protein of PP2A regulatory subunit using the proteomics technology. This study would provide new molecular genetic markers for genetic diagnosis and pathogenesis research of DCM.

冠心病、高血压和心肌病是致心衰的三大疾病。扩张型心肌病（DCM）由于发病机制不明，缺乏特异性的治疗手段，预后差。遗传因素是DCM的主要原因，但已知候选基因仅能解释50%的遗传性DCM的病因。项目组前期在DCM家系中发现1个新的致病基因"蛋白磷酸酶2A（PP2A）调节亚单位"的基因突变，并构建了该基因敲降和敲除的斑马鱼疾病模型。结合文献报道PP2A和其调节亚单位成员在DCM和心衰中的作用，我们推测PP2A调节亚单位是DCM新的致病基因。为进一步证实和阐明其致DCM的功能，拟:筛查PP2A调节亚单位的新突变位点；鉴定基因敲除斑马鱼疾病模型:挽救实验、心脏宏观和微观结构观察、心功能检测；突变型和野生型质粒转染肌细胞系，比较其对肌细胞的影响；基因敲除斑马鱼的基因表达谱分析及疾病通路预测；寻找PP2A调节亚单位的互作蛋白。本研究将为DCM的基因诊断、发病机制研究提供新的分子遗传标志物。

蛋白磷酸酶2（PP2A）是丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，由结构亚单位、催化亚单位和调节亚单位构成。调节亚单位调控着PP2A全酶的活性、底物特异性以及亚细胞定位。PPP2R3A为PP2A的调节亚单位之一， PR72和PR130为PPP2R3A的两个剪接体，具有相同的C末端和不同的N末端，均调控Wnt通路。.在扩张型心肌病伴房室传导阻滞家系中，前期发现与疾病共分离的PR72杂合突变R9Q，又在82例扩心病患者中筛查了PR72的新突变。随后从斑马鱼敲除、真核细胞过表达和转基因小鼠模型层面进行了以下研究：1. Talen技术敲除斑马鱼pr72 原位杂交发现突变鱼心脏环化不全，回补实验证实环化不全是由pr72敲除所致。心功能分析实验发现突变鱼心功能下降。HE染色显示突变鱼心肌结构异常，心肌组织松散，心室腔变大，心肌细胞数减少。透射电镜观察其心肌结构紊乱，线粒体肿胀，细胞核周围空隙及水肿，Z线变宽，明带不清。2. 表达谱分析 表达谱结果提示pr72敲除所致表型，可能通过激活经典的Wnt通路实现。且PR72在肌细胞系中低表达，但C2C12诱导细胞肌管形成后其表达增加。3. 免疫共沉淀检测PR72R9Q对蛋白互作的影响 PR72R9Q对Nkd1与PP2Ac/PR65核酶的结合无显著影响。4. PR72过表达质粒转染H9c2细胞 共聚焦显微镜观察突变未影响蛋白定位，流式细胞仪检测发现突变型组细胞周期S期细胞比例轻度降低，早期凋亡细胞比例轻度增加。5. 心脏特异性表达PR72R9Q转基因小鼠 转基因小鼠心脏相同量PR72蛋白中PP2A活性降低。PET结果显示转基因小鼠心脏对葡萄糖的摄取显著高于对照组。经STZ诱导糖尿病模型后，转基因小鼠血糖水平升高程度显著升高。.我们也研究了PR130在心脏中的功能，用CRISPR/Cas9技术敲除pr130，突变鱼死亡率增加，心脏环化不全，HE染色和透射电镜观察到心脏结构紊乱，心肌细胞数减少，Tunnel染色结果提示心肌细胞凋亡增加。.总之，PP2A调节亚单位pr72和pr130在斑马鱼心脏发育过程中均起着重要作用，PR72R9Q可能在心脏PP2A活性和能量代谢中起着一定作用。.此外，发现pr130基因敲除增强了斑马鱼对胰岛素的敏感性，肝脏甘油三酯含量降低，具体分子机制尚需要在体实验的数据支持。

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