抵抗NK细胞杀伤的新型UCART-CD19细胞体系建立与抗肿瘤作用的研究

Numerous studies have indicated that chimeric antigen receptor-modified T (CART) cells have shown great success in hematologic malignancies, especially in CD19-positive acute-lymphoblastic leukemia. Autologous T cells are be engineered to express chimeric antigen receptor (CAR) and be used in mostly recent clinical studies; however, it is not always possible to manufacture an effective therapeutic autologous CART cell product in heavily treated cancer patients and especially in infants because of low T cell numbers and poor T cell quality or because the risk of undergoing apheresis is too great. Recent studies have indicated that knocking out the endogenous TCR through gene editing is one approach that has been described to generate universal allogeneic donor cells incapable of mediating graft-versus-host-disease (GVHD). On the basic of above, eliminating expression of the endogenous HLA class I can minimize the risk of host-mediated rejection of allogeneic cells, whereas these HLA class I-negative cells can be lysed by natural killer (NK) cells through the missing-self response. Nevertheless, the forced expression of minimal polymorphic HLA-E(G) protein on allogeneic cells, one of non-classical HLA class I molecules and a ligand for the inhibitory NKG2A/KIR2DL4 expressed on majority of NK cells, can inhibit the cytotoxicity of NK cells, as well as escape allogeneic responses. In this study, we will eliminate the expression of endogenous TCR and HLA class I by using CRISPR/Cas9, and simultaneously force HLA-E(G) expression on CART cells to inhibit NK cell-mediated lysis. The completion of this study will undoubtedly provide highlight prospective for patients who cannot receive autologous CART cell treatment, and it will produce a powerful driving force for the extensive clinical application of UCART cells.

目前自体嵌合抗原受体修饰的T（CART）细胞已在恶性血液系统肿瘤中取得了突出的临床疗效，但部分患者因多种原因无法扩增足够数量的CART细胞而错过最佳治疗时机。通过基因编辑技术敲除异体细胞TCR与HLA-I基因制备通用型CART（UCART）细胞可能是解决该问题的有效途径之一，然而此类UCART细胞将会被受者NK细胞攻击，导致其在患者体内难以长期存活。我们前期发现通过导入HLA-E（G）可以有效促使TCR与HLA-I敲除的CART细胞免受异体NK细胞攻击。本项目将1）进一步完善过表达HLA-E（G）的新型UCART-CD19细胞制备技术体系；2）从细胞与动物水平明确新型UCART-CD19细胞抵抗异体NK细胞杀伤的作用，并对其抗瘤作用进行评估；3）从分子水平验证新型UCART-CD19细胞是否通过HLA-E（G）途径抵抗异体NK细胞杀伤。该项目的完成将为新型UCART细胞的临床应用奠定基础。

尽管 CAR T 细胞在血液肿瘤治疗上获得了巨大成功，但目前在绝大多数临床研究中使用患者自体来源的CAR T细胞，从而造成在细胞制备、输出条件与成本上不尽相同。此外，对于前期重度治疗的患者，由于自体 T 细胞数量低和质量差，无法满足获得临床应用数量级 CAR T 细胞，导致无法获得该治疗。而已招募入组患者也必须等待CAR T细胞的制备与质检，在此期间出现的任何问题，对患者都是具有打击性的。针对该问题，本课题通过基因编辑技术建立了过表达 HLA-E（G）的 TCR 与 HLA-I 双阴性UCAR T-CD19细胞制备技术体系。该类UCAR T细胞的生物学特性，包括细胞表面标识、抗瘤能力，不会因基因编辑而改变。此外，过表达 HLA-E（G）的 TCR 与 HLA-I 双阴性UCAR T-CD19细胞被异体T细胞识别的能力降低，并能够抵抗异体NK细胞的杀伤。在此基础上，开展了2例UCAR T细胞治疗复发难治性弥漫大B细胞淋巴瘤的临床试验，患者外周血中B细胞数量均维持在较低水平，提示UCAR T细胞体内能够发挥有效的抗瘤作用。2例患者除了发生细胞因子释放综合症，均未观察到GVHD与其他毒性。在基础研究基础上，分别开展了CAR T-38与CAR T-EGFR细胞治疗1例复发性B急性淋巴细胞白血病与16例转移性胰腺癌临床试验。在CAR T-38细胞临床试验中，观察到了脱靶毒性以及严重的细胞因子释放综合症，并观察到CD38阳性肿瘤细胞被清除，提示尽管CART-38细胞体内具有抗瘤作用，但会导致严重的毒性。在CAR T-EGFR细胞临床试验中，5例患者获得了2至4个月的部分缓解，同时观察到CAR T-EGFR细胞治疗耐受性良好。相关性分析证实CAR T细胞中中枢记忆性T细胞的含量与临床疗效呈正相关。该项目的完成为新型UCAR T细胞的临床应用奠定基础。

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