珍珠贝外套膜胶原蛋白（类V型胶原蛋白）活性肽的制备、生物学活性评价及其构效关系研究

Shellfish Mantle Collagen is classified in TypeⅤLike Collagen(TVLC).It has significant differences with amino acid composition evidently, which existing in nature and discovered different physiological activity of active collagen peptide under the action of the enzymes. In order to make clear the biological activity of TVLC , we took advantage of the research results having gained in TVLC preparations. We have devised schemes for preparing TVLC peptide using complex enzymes. Furthermore, we developed to select and separate the active peptide utilizing Invitro model to analyze the structure-activity relationship between the structure of the active peptide and its biological activity. (1)To investigate the enzymatic characteristics of Pearl Shell Mantle Collage and the controlled preparation of the active peptide components. (2)To set up biological activity evaluation model systems for normal skin fibroblast(NHDF)、MC3T3-E1 and RAW264 respectively.(3) To take fractional separation from different Bioactivity component successively and identify the amino acid sequence structure after analyzed the differences between structure and activity, after which having been contrasted with the active peptide in BIOPEP. It may be expected that the project could establish the valuable theoretical basis for further research and application on high-active peptides by evaluating collagen active peptide sequence structure.

贝类外套膜胶原蛋白属于类V型胶原蛋白（以下简称TVLC），与自然界中广泛存在的I型胶原蛋白在氨基酸组成上有显著的差异，据发现，酶解后会产生与I型胶原蛋白肽结构不同的肽。为了确定TVLC肽的生物学活性，本项目利用已取得的制备TVLC研究成果，通过复合酶解法制备TVLC肽，采用体外细胞模型筛选分离活性肽（以下简称AP），分析AP结构与其生物学活性之间的构效关系。 (1)探讨珍珠贝外套膜胶原蛋白的酶解特性及AP组分的调控制备；(2)分别建立常人皮肤成纤维细胞(NHDF)、小鼠成骨细胞株（MC3T3-E1）和破骨前驱细胞株（RAW264）的生物学活性评价模型体系；(3)从不同活性组分中逐级分离、鉴定高活性肽的氨基酸序列结构，并与生物活性肽数据库（BIOPEP）中的AP进行比对，分析其结构与活性的差异。通过鉴定活性胶原蛋白肽的结构，为高活性肽的研究应用奠定理论基础。

为了解明在动物的衍化过程中至今仍然存在，并且资源非常丰富的水产类V型胶原蛋白酶解产物的生物学活性，首先从珍珠贝外套膜中提取类V型胶原蛋白进行酶解反应获得胶原蛋白肽, 探讨了类V型胶原蛋白肽的制备及抗氧化肽的分离方法;其次分别采用小白鼠成骨细胞(MC3T3-E1) 建立AMA诱导的MC3T3-E1细胞氧化损伤模型; 用MC3T3-E1细胞和破骨前驱细胞(RAW264)建立体外骨质疏松症抑制模型; 用NHDF细胞建立真皮细胞2D培养模型，分别探讨了类V型胶原蛋白肽的抑制骨质疏松作用及其机理和对NHDF细胞增殖性的影响等生物学作用。. 结果表明,1.珍珠贝外套膜中粗蛋白含量为9.80 g/100g（以湿基计），其中胶原蛋白含量为5.60 g/100g（以湿基计），占粗蛋白含量的57.14%。经氨基酸组成分析得知，珍珠贝外套膜胶原蛋白在氨基酸组成上与I型胶原蛋白相比有显著差异,是富含酸性氨基酸的类V型胶原蛋白。2. 先后采用碱性蛋白酶和中性蛋白酶酶解热水提取珍珠贝外套膜胶原蛋白,再经凝胶层析分离获得分子量分布在300-600Da的抗氧化性较强的胶原蛋白肽组分,当其浓度为0.5 mg(P)/mL 时DPPH自由基清除率和羟基自由基清除率分别为32.05%和24.72%, 上述组分显示出对抗霉素A诱导的MC3T3-E1细胞氧化损伤具有显著的保护作用,可提高MC3T3-E1细胞活力、碱性磷酸酶分泌量和矿化的能力。3. 珍珠贝胶原蛋白肽具有促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化和抑制破骨细胞的作用（抗骨质疏松效果）取决于胶原蛋白的类型、来源、酶解方式和分子量大小。特别是，胶原蛋白肽与锌的螯合物对MC3T3-E1细胞的增殖和分化以及破骨细胞的增殖抑制作用明显提高，珍珠贝外套膜胶原蛋白肽与锌的螯合物效果显著优于罗非鱼胶原蛋白肽。4. 珍珠贝外套膜胶原蛋白肽具有促进NHDF细胞增殖的作用,但效果不显著.. 通过本项目的研究阐明了利用复合酶法制备水产类V型胶原蛋白活性肽的有效途径，揭示了水产类V型胶原蛋白肽的抑制骨质疏松症作用及其机理，特别是发现水产类V型胶原蛋白肽与I型胶原蛋白肽相比，具有更强的锌鳌合能力，而且胶原蛋白肽与锌的螯合物的抑制骨质疏松效果显著。

内容获取失败，请点击重试