基于T7 RNA聚合酶和RNA聚合酶III体内转录的水稻条纹病毒反向遗传学体系构建

Rice stripe tenuivirus (RSV) and related cytoplasmic plant negative stranded RNA (NSR) viruses account for enormous crop diseases worldwide; however, our understanding of their pathogenesis has been greatly hindered by the unavailability of reverse genetics approach for this group of viruses. The minimal infection unit of NSR viruses are viral ribonucleoprotein complex (RNP) consisting of viral genome and replication-related core proteins including nucleocapsid protein and RNA-dependent RNA polymerase. The state of the art studies indicate that the commonly used T7 polymerase (T7 Pol) in vitro transcription and RNA polymerase II (Pol II) in vivo transcription systems are not widely suitable for genetic engineering of cytoplasmic NSR viruses. In order to tackle down this technical problem, we have developed T7 Pol in vivo transcription system and RNA polymerase III in vivo transcription systems in plants during our pilot studies. The current project aims to employ two approaches on the basis of the two systems, respectively, to build RSV reverse genetics systems. First, to construct the T7 Pol based-RSV reverse genetic system, we plan to use T7 Pol expressed in Nicotiana benthamiana plants to direct in vivo transcription of RSV minireplicon RNA. Cap-independent translation enhancer sequence derived from a varieties of positive stranded RNA viruses will be used to facilitate the expression of T7 transcripts encoding viral core proteins. Second, for the Pol III-based RSV reverse genetic system, Pol III promoter controlled transcription of RSV minireplicon RNA will be optimized. Meanwhile, 35S promoter controlled expression of viral core proteins will be improved by mitigation of RNA polymerase II transcription-coupled mRNA splicing. Our studies promise to resolve the most serious technical hurdle plaguing genetic manipulation of plant NSR viruses, and should provide a foundation for construction of full-length infectious cDNA clone that are essential for virus biology and pathology characterization.

水稻条纹病毒（RSV）等细胞质负链RNA病毒严重危害作物生产，然而，该类病毒致病机理研究受制于缺乏反向遗传学技术体系。负链RNA病毒的最小侵染单元为核糖核蛋白复合体，目前常用的RNA病毒cDNA克隆转录方案难以有效用于该类病毒的遗传工程操作。为此，课题组在前期构建了基于T7 聚合酶（T7 Pol）和RNA聚合酶III（Pol III）的体内转录方法。本项目拟据此设计两套技术方案：1）通过植物体内表达的T7 Pol转录病毒RNA，并利用不依赖帽子结构的翻译元件促进病毒核心蛋白的表达；2）优化Pol III转录病毒RNA的技术方案，并解决35S启动子转录核心蛋白mRNA伴随的剪接问题，提高其表达效率。在此基础上，建立基于T7 Pol和Pol III转录的RSV反向遗传学体系。本项目的实施有望突破制约该类病毒遗传操作的技术障碍，为构建全长侵染性cDNA 克隆打下基础，推动其生物学和病理学研究。

水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）属于负链RNA病毒的纤细病毒属，所引起的水稻条纹叶枯病是亚洲国家普遍发生的毁灭性水稻病害，也是近年来我国水稻产区发生最为严重的病毒病害之一。病毒反向遗传学是研究病毒基因组结构、病毒编码蛋白功能、病毒与宿主之间相互作用以及开发利用病毒载体的重要手段。RSV反向遗传学的缺失制约了对RSV病毒学和病理学的研究、病毒与植物及介体昆虫相互作用的研究。负链病毒基因组无侵染性，其最小侵染单元是核糖核蛋白（RNP），由被核衣壳（N）蛋白包裹的病毒基因组RNA及病毒RNA依赖的RNA聚合酶大蛋白（L）组成。本项目的目标是探索不同体内转录系统在RSV反向遗传学构建中的适用性。本研究首先尝试发展基于T7 RNA聚合酶（T7 Pol）和RNA聚合酶III（Pol III）的负链RNA病毒微型复制子反向遗传学体系。利用T7转录体系和项目组前期已建立的苦苣菜黄网弹状病毒（SYNV）反向遗传学体系，发现基于T7 Pol转录系统的SYNV微型复制子拯救效率远低于前期构建的RNA聚合酶II（Pol II）转录体系。分别克隆了拟南芥3个Pol III启动子（ptRNA、pU3B和pU6），并成功实现了SYNV微型复制子和重组病毒拯救，但其效率较Pol II较低。无论T7 Pol还是Pol III均未能实现RSV微型复制子拯救，于是我们转而利用Pol II系统尝试RSV反向遗传学构建。对RSV的L基因进行了密码子优化，有限避免了Pol II转录本伴随的mRNA剪切问题，成功表达了L的全长蛋白，并建立了RSV RNA1-4微型复制子系统。利用建立的微型复制子系统，对RSV RNA3顺式作用元件以及NS3蛋白功能进行了研究，发现顺式作用元件是病毒复制转录所必须的，而NS3以剂量依赖型的方式特异性地抑制微型复制子的表达，并且开发了研究RSV胞间运动的微型复制子系统。此外，发现RSV RNA1和RNA3反基因组链的Pol II转录本可以直接作为翻译模板产生N和L蛋白，而这些顺式表达的核心蛋白足以支持RSV微型复制子的复制转录，建立了无需核心蛋白表达载体的RSV微型复制子反向遗传学系统。因此，RSV反向遗传学系统的建立为研究RSV复制、转录和胞间运动提供了重要的技术手段。

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