细胞壁蛋白GbEXPATR结构解析及棉纤维细胞壁属性与纤维品质相关性探究

Cotton is an important cash crop. Currently, there is a shortage of the supply of cotton fiber with high quality that is suitable for our current high-grade yarn spinning, so enhancement of the quality of cotton fiber is urgent. The fiber fineness, length, strength are 3 important fiber quality indicators, which were determined by secondary cell wall of cotton fiber. Previous researches have shown that there is obvious correlation between fiber cell wall and fiber quality. Since 1992 expansin was found, this acid induced cell wall protein that can irreversibly loosen and stretch cell wall has been a research focus. We have cloned the GbEXPATR, a sea-island-cotton-specific expansin missing second domain. GbEXPATR can promote fiber of upland cotton to become longer, thinner and stronger by changing the secondary cell wall synthesis process and the composition of cell wall polysaccharides. This study will further analysis the mechanism of GbEXPATR on cell wall. We will resolve crystal structure of GbEXPATR protein and elucidate the function of two domains of expansin. Then we will take GWAS with a cotton natural population whose re-sequencing has been completed to elucidate the correlation between secondary cell wall and fiber quality, and to clone candidate genes involved in cell wall synthesis and determining fiber quality.

棉花是重要的经济作物，当前我国适合纺中高档纱的高等级棉供应偏紧，棉花纤维品质亟待提升。棉花纤维次生壁的属性及次生壁发育进程是决定纤维细度、长度、强度这3个纤维品质指标的重要因素，已有的研究也表明纤维细胞壁与纤维品质有重要的关系。自1992年发现expansin以来，关于这个在酸性条件诱导细胞壁松弛和不可逆伸展的细胞壁蛋白一直都是研究的热点。本实验室前期克隆了海岛棉特异的缺少第二个结构域的expansin基因GbEXPATR。GbEXPATR通过推后次生壁合成进程及改变细胞壁多糖成分来促进转基因陆地棉变长变细变强。本项目将深入研究GbEXPATR的作用机制，解析GbEXPATR蛋白晶体结构，阐明expansin两个结构域的作用机理。并以此为切入点，利用已完成重测序的自然群体进行GWAS分析，解析不同次生壁成分与纤维品质的相关性，克隆细胞壁合成相关及决定纤维品质的候选基因。

体外重组表达了GbEXLA1，尝试并掌握该蛋白结晶的条件，获得可以用于X-ray衍射的晶体样品。通过体外实验分析了GbEXLA1不具备细胞壁多糖的水解能力，后续将持续优化结晶条件并完成蛋白结构的解析。利用冷冻电镜解析了GhCesA7蛋白的三维结构，发现该蛋白以三聚体形式作用，催化纤维素微纤丝的合成。解析细胞壁合成相关蛋白的三维结构，有助于了解细胞壁蛋白的功能活性位点和参与纤维细胞壁合成的功能特性。.验证了一个编码细胞壁蛋白的基因GbGLP2的功能，在陆地棉中超表达GbGLP2，纤维长度变短，干涉同源基因GhGLP1后纤维长度变长，说明GhGLP1负调控纤维长度发育。通过测定不同株系10DPA纤维样品的转录组，分析发现下调表达GhGLP1后与次生细胞壁合成相关的基因表达量也降低，自然群体中长纤维材料的15DPA纤维样品这类基因的表达水平也低于短纤维的同类基因，表明推迟纤维次生壁合成相关基因的表达有助于增加纤维长度。.验证了一个编码GRAM蛋白的基因GhGRAM31的功能，干涉GhGRAM31后纤维显著变短，衣分降低。差异基因表达分析表明，GhGRAM31下调表达造成纤维中次生壁合成基因的上调表达和细胞伸长相关基因的下调表达。系列蛋白互作实验证实GhGRAM31蛋白与同源蛋白GhGRAM5和GhGRAM35互作，后面两者分别与GhTTG1和GhHD1互作。转录激活实验结果表明，GhGRAM31和GhGRAM35共同作用能显著增强GhHD1对促进纤维伸长的基因GhEXPA1的转录激活作用。这些结果表明GRAM蛋白通过相互作用参与基因的转录调控，从而影响纤维发育。.针对一个具有251份个体的自然群体材料进行纤维性状考察，取15DPA的纤维样品进行转录组测序，20DPA纤维样品经过冷冻干燥后用于测定细胞壁的多糖成分。通过GWAS、eQTL和TWAS联合分析，鉴定到多个调控基因表达和纤维农艺性状的热点区域。20DPA纤维样品的细胞壁多糖组分与纤维农艺性状相关性分析表明细胞壁多糖与纤维长度和马克隆指数有显著的相关性。以细胞壁多糖数据作为表型进行GWAS分析，表明D11染色体的24.2-24.8 Mb区段与多种细胞壁多糖成分显著关联，该区段显著调控纤维长度，并且是调控次生壁相关基因表达的eQTL热点区间，说明该区域的基因参与调控棉花纤维细胞壁合成并决定着纤维品质表型。

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