人口腔上皮细胞染色体开放区域在唇腭裂发病机制研究中的应用

Orofacial clefting is the most common craniofacial birth defect and has a strong genetic underpinning. Genome-wide association studies have detected common variants associated with this disorder, most of which lie in the non-coding DNA segments near genes highly expressed in the oral epithelium. However, due to poor understanding on the connection between the sequence and function of non-coding DNA, how these associated variants affect oral epithelium developemnt and increase the risk of orofacial clefting remain largely unknown. Previous studies have shown that, in a genomic context, most of functional non-coding genomic DNA sequences are tissue-specific open chromatin regions. Thus, to fill this knowledge gap, we are proposing to identify oral epithelium-specific open chromatin regions by using ATAC-seq and in vivo/vitro oral epithelium cell reporter systems. We will then systematically investigate the sequence composition of these DNA segments through a supervised machine-learning algorithm. Based on these findings, we will take KLF4, a known transcription factor important for oral epithelium differentiation, as an example, to further analyze the KLF4-dependent oral epithelium-specific open chromatin regions and the related gene regulatory network using Klf4 knockout oral epithelium cells and mice. Lastly, we seek to identify common variants affecting oral epithelium-specific open chromatin regions. This novel project will deepen our understanding of the gene regulation network governing oral epithelium differentiation, and provide new insight into the mechanism by which functional variants alter development of the oral epithelium.

唇腭裂是口腔最常见的先天性颅颌面缺损，部分患儿的发病与其遗传背景有关。GWAS等研究揭示了多个与该疾病相关的易感基因位点位于口腔上皮相关基因附近的非编码DNA区域。但是，由于缺乏对口腔上皮细胞非编码DNA区域的功能注释，这些 “相关”突变如何影响口腔上皮功能进而增加患病风险的生物学机制仍有待阐明。以往研究显示，基因组非编码DNA的功能发挥伴随着所在染色体的组织特异性局部开放。鉴于此，本项目将利用ATAC-seq和口腔上皮细胞体内外模型鉴定该组织相关的染色体开放区域，以机器学习总结这些区域DNA序列特征；然后，针对一个已知的口腔上皮关键转录因子KLF4，利用口腔上皮细胞特异敲除该基因的体内外模型研究其调控的口腔上皮染色体开放区域及相关基因调控网络；最终应用机器学习和基因编辑手段对GWAS等所报道的唇腭裂上皮相关突变进行预测和生物学鉴定。本项目的将为唇腭裂非编码区突变发病机制研究提供新的思路。

唇腭裂是口腔最常见的先天性颅颌面缺损，部分患儿的发病与其遗传背景有关。GWAS等研 究揭示了多个与该疾病相关的易感基因位点位于口腔上皮相关基因附近的非编码DNA区域。但是，由于缺乏对口腔上皮细胞非编码DNA区域的功能注释，这些 “相关”突变如何影响口腔 上皮功能进而增加患病风险的生物学机制仍有待阐明。以往研究显示，基因组非编码DNA的功能发挥伴随着所在染色体的组织特异性局部开放。 在该自然科学基金面上项目资助下，围绕“口腔上皮细胞染色质开放区域” 和“唇腭裂遗传结果功能解读”两个关键词，项目组采用多种模式动物、多种功能基因组学技术、机器学习以及分子生物学实验等手段拓展既定的研究内容， 共从以下五个方面取得重要进展：1）利用ATAC-seq，H3K27Ac ChIP-seq，RNA-Seq等技术结合机器学习总结斑马鱼、小鼠和人类口腔上皮细胞组织特异性染色质开放区域的“保守特征”; 2）利用该保守特征解读既往发表唇腭裂GWAS遗传相关结果，并进行体内外功能验证；3）对人口腔上皮细胞开展DLO-HiC测序工作，建立人口腔上皮细胞的“连接组”，利用该数据结合项目产生的其他表观遗传组学数据从已经发表的唇腭裂GWAS数据中发现新的唇腭裂致病突变；4）利用K14Cre基因敲除小鼠和谱系示踪配合单细胞RNAseq技术解释口腔上皮细胞内Klf4相关的基因调控网络；5）初步探索腭上皮发育过程中细胞谱系异质性。项目共资助相关结果发表论文14篇，协助培养两名博士研究生毕业，其中一位在国际会议获奖。本项目的研究结果一方面奠定了斑马鱼等较低等模式动物用于研究唇腭裂的理论基础，另一方面也为预 测非编码区 DNA 改变能否影响组织特异性增强子活性提供依据。而基于此理 论形成的机器学习模式将以极快的速度和极低的成本的对这些 DNA 碱基“致病性”进行排序，为唇腭裂功能研究提供“高通量”筛选方法。 项目在项目末期发现的口腔周皮来源异质性现象也将在后续工作中继续细化，以揭示口腔上皮分化特有的异质性和优化唇腭裂遗传结果功能研究。

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