苏云金芽胞杆菌新型杀虫蛋白ET-012对水稻褐飞虱的杀虫机理研究

With the long-term and large-scale use of chemical pesticides, the rice planthoppers developed violent resistance to most chemical pesticides, resulted in more and more seriously damage to rice production in the past few years in China. Bacillus thuringiensis (Bt)-produced insecticidal crystal proteins have been used successfully in pest control in the forms of bio-pesticides and transgenic crops. However, only a few genes were identified to be toxic to the Hemiptera pests with low activity and unclear insecticidal mechanism. Here a novel insecticidal crystal protein ET-012, from a Bt strain isolated from mountainous jungle in Jiangxi province, was identified to have high insecticidal activity against the rice brown planthopper (BPH) in our preliminary work. To further understand the insecticidal mechanism of the protein against the BPH in biochemistry, histopathology and molecular level, the following four issues will be clarified in this study: (1) the solubility of the protein ET-012 in different PH values, (2) the proteolytic characteristic of the protein ET-012 by BPH midgut proteases, (3) the interaction of the protein ET-012 with BPH brush border membrane vesicles (BBMV), and (4) the protein ET-012-induced damage to BPH midgut epithelium. The results will not only broaden new insight to insecticidal mechanism of Bt crystal proteins in Hemiptera pests, but also provide theoretical basis on application of the insecticidal protein in BPH-resistant transgenic rice, and on direction of more BPH-killing insecticidal proteins discovery.

由于化学农药的长期大量使用，稻飞虱的抗药性日渐增强，危害逐年加重，严重威胁着我国的粮食安全。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）是杀虫微生物的典型代表，为我国在世界领先的水稻转基因抗虫育种研究提供了丰富的基因支持。但是目前Bt杀半翅目害虫的基因数量少，活性低，杀虫机制不明，特别是杀稻飞虱的基因至今未见报道。本研究团队从江西省筛选到的Bt菌株中鉴定到1个对褐飞虱有较高活性的杀虫晶体蛋白ET-012。基因序列分析的结果显示该蛋白与已知杀虫蛋白的同源性只有32.8%，是一类新的杀虫晶体蛋白。本项目将对该新型杀虫蛋白在褐飞虱肠道内的溶解性、酶解特性、结合特异性及其引起的肠道组织病理变化等进行系统研究，阐明该新型杀虫蛋白在生化、组织病理和分子水平对褐飞虱的杀虫机制，为其转基因抗虫育种研究和应用奠定理论基础，同时为指导更多稻飞虱杀虫蛋白基因的挖掘提供理论依据。

为了应对水稻褐飞虱的危害及其抗药性，本项目通过基因组测序从筛选到的苏云金芽胞杆菌杀虫活性菌株中克隆到了潜在的新型杀虫基因，并通过研究杀虫蛋白在褐飞虱肠道的溶解性、酶解特性、结合特异性及其引起肠道组织的病理变化等来阐述其杀虫机理。.本项目完成了包括目标菌株JXBT-012在内的共6个活性菌株的基因组测序工作，并克隆到了包括目标蛋白ET-012在内的共6个杀虫蛋白的基因。本项目构建了携带杀虫基因重组载体，并先后在大肠杆菌和芽胞杆菌中表达。结果显示这种新型的杀虫蛋白和之前报道的蛋白有很大的不同，在大肠杆菌中很难表达，在芽胞杆菌中能够成功表达，但是和常见的杀虫蛋白相比表达量很小，而且晶体和溶解蛋白的稳定性也很差，在制备和纯化过程中很容易降解，影响后续的研究和应用。本项目对杀虫蛋白的溶解性、酶解特性和结合特异性做了多次尝试，但因蛋白质稳定性的问题都没有得到很好的结果。.为了解决蛋白质稳定性的问题，本项目尝试在制备蛋白过程中添加蛋白酶抑制剂，结果显示蛋白酶抑制剂能够缓解蛋白降解的问题，但是对酶解特性、生物活性、以及结合特异性有很大的影响，没有获得很好的结果。.针对该类型杀虫蛋白稳定性差的问题，后续项目需要研究的内容包括：（1）构建蛋白的系列点突变体，筛选稳定性好、杀虫活性高的突变体。（2）尝试更换表达宿主、或者更换表达的启动子。（3）通过研究杀虫蛋白高效表达的机制和蛋白质稳定性机制，包括转录或翻译调控、折叠帮助蛋白等，解决杀虫蛋白稳定性问题。.

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