植物负链RNA弹状病毒侵染性cDNA克隆构建及反向遗传学分析

Infectious clone-based reverse genetics approach is the most fundamental and essential technique in modern molecular virology. Although reverse genetics has been applied to animal negative-strand RNA viruses for nearly 20 years, unfortunately, application of similar approach to plant counterparts has not been accomplished so far, which greatly limits our ability to genetically manipulate plant negative-strand viruses. Previously, our laboratory has established an efficient minireplicon-based reverse genetics approach to study a plant rhabdovirus, Sonchus yellow net virus (SYNV), which set up a solid platform for construction of full-length infectious clone. On the basis of this approach, the present study aimed to further optimize the SYNV minireplicon derivatives, and to sequentially construct more complex minigenome and full-length clone. We use bottom-up approaches and design multiple experimentation schemes to tackle down the most serious technical hurdles of reverse genetics analysis of plant negative-stranded viruses, including promoter design, authetic 5' and 3'-termini sequences and inefficiency inherent in multi-components and long template. Our approach should also be applicable to other members of plant negative-strand viruses which collectively cause an enormous number of economically important crop diseases and facilitate the fundamental and applied studies of those viruses.

以侵染性克隆技术为核心的反向遗传学分析是现代分子病毒学研究中最基本、最重要的技术手段，然而迄今为止，国际上尚未有植物负链RNA病毒侵染性cDNA克隆成功构建的报道，这严重制约了该类病毒的基础和应用研究。申请者实验室在前期工作中，以弹状病毒科苦苣菜黄网病毒（SYNV）为模式，建立了高效的SYNV微型复制子（minireplicon）反向遗传学体系，为全长侵染性克隆构建打下了坚实的基础。本项目拟在此基础上，进一步优化微型复制子工作效率，并依次构建微型基因组（minigenome）和全长cDNA克隆，逐步解决影响克隆侵染性的技术难点，如启动子利用、末端序列的忠实性和病毒组份多，模板长伴随的低效问题，最终获得SYNV侵染性cDNA克隆，并建立反向遗传学技术体系。本项目的实施可望突破破制约植物负链RNA病毒研究的主要技术障碍，推动其它重要作物负链病毒的反向遗传学研究，具有重要的理论意义和应用价值。

病毒侵染性克隆技术使对病毒基因组进行遗传操作成为可能，是现代分子病毒学研究中最基本、最重要的技术手段。在本课题开展之前，国际上尚未有植物负链RNA病毒侵染性cDNA克隆成功构建的报道，严重制约了该类病毒的基础和应用研究。申请者实验室以弹状病毒科苦苣菜黄网病毒（SYNV）为模式，在项目前期建立的SYNV微型复制子（minireplicon）反向遗传学体系基础上，通过优化微型复制子工作效率，逐步解决制约侵染性克隆构建的技术难点，最终获得SYNV侵染性cDNA克隆，并建立反向遗传学技术体系；构建了基于酵母同源重组的克隆体系，将SYNV拯救所需的质粒数目从7个减少到3个，提高了侵染效率，为复杂RNA病毒的侵染性克隆构建提供了新的技术手段；在SYNV侵染性克隆的基础上，构建GFP等外源基因表达载体，利用反向遗传学手段研究了病毒胞间运动和病毒粒子形态建成的机理；证明SYNV sc4蛋白为病毒编码的运动蛋白，而最小的运动单元为核衣壳（nucleocapsid）；明确了病毒基质蛋白（M）和糖蛋白（G）为病毒粒子形态建成所必需，核膜定位的G蛋白通过其C端尾巴招募M蛋白，诱导核内膜内陷，为病毒粒子出芽提供场所。本研究首次成功构建了植物负链RNA病毒反向遗传学体系，为该类病毒遗传学研究扫出来技术障碍，同时也为植物弹状病毒分子生物学研究和病毒载体开发掀开了新的篇章。

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