WRKY类转录因子在托品烷类生物碱生物合成中的调控作用研究

Transcritional regualtion of plant secondary metabolite biosynthetic pathways is a hot field of plant science. The functional genes involved in tropane alkaloid (TAs) biosynthesis have been intensively studied and metabolic engineering of TAs biosynthesis is very successful. Unfortunately, there are no reports on transcription factors regulating TAs biosynthesis. In the proposal, we will study WRKY transcription factors (TFs) regulating TAs biosynthesis. Atropa belladonna, the medicine-source plant of TAs authorized by Chinese Pharmacopoeia, is used as the plant material. We respectively isolated the promoter of PMT and H6H and found that both of them had the W box that was the binding site of WRKY TFs. The WRKY TFs, of which expression are coordinate with the functional genes involved in TAs pathway such as PMT, CYP80F1, TRI and H6H, are the candidate TFs controling TAs biosynthesis. The candidate WRKY TFs can be isolated based on the sequenced transcritomes of different organs of A. belladonna and expression profile analysis of WRKY and the four TAs-pathway functional genes. Then EMSA will be used to test the binding of WRKY to the W boxs in the promoters of PMT, CYP80F1, TRI and H6H; yeast one-hybird will be applied to investigate the activition of the promoters of the four genes by WRKY. Finally, the WRKY TFs will be decreased by RNAi or be increased by overexpression at the transcritional levels in A. belladonna via transgenic technology; and expression of genes involved in TAs biosynthetic pathway and corresponding metabolites will be analyzed in transgenic A. belladonna (WRKY RNAi / Overexpression). All the researches above will explain molecular mechanism of WRKY TFs regulating biosynthesis of TAs.

植物次生代谢产物生物合成转录调控是植物科学研究热点之一。托品烷类生物碱（TAs）生物合成途径功能基因和代谢工程研究很深入，但TAs生物合成转录调控研究还没有报道。 本研究拟开展WRKY类转录因子在TAs生物合成中的调控作用研究。以药典收录TAs药源植物颠茄为材料，以颠茄不同组织转录组测序结果和TAs途径功能基因启动子分析为基础，分离鉴定与TAs合成途径中PMT、TRI、CYP80F1和H6H等功能基因表达具有协同作用的WRKY；通过EMSA分析WRKY与PMT、TRI、CYP80F1和H6H启动子结合活性，采用酵母单杂交和瞬时表达分析WRKY对这4个基因启动子的激活活性；最后采用转基因方法在颠茄发根中实现WRKY的RNAi和Overexpression，研究转WRKY基因对TAs生物合成途径相关基因表达和对应代谢产物合成的影响，从而阐明WRKY转录因子调控TAs生物合成的分子机理。

莨菪碱（Hyoscyamine）和东莨菪碱（Scopolamine）属于托品烷生物碱（Tropane Alkaloids，TAs），是临床上常用抗胆碱类基本药物。茄科药用植物颠茄（Atropa belladonna）、天仙子（Hyoscyamus niger）和曼陀罗（Datura species）等都能够产TAs，其中颠茄是最为重要的商业药材，但TAs在天然植物中含量较低。TAs生物合成途径中PMT，TRI，CYP80F1和H6H等重要基因已经报道，但该途径还未完全解析，其转录调控研究还未见报道。本研究以颠茄为材料，综合采用分子生物学、生物化学和生物技术等方法和手段研究WRKY类转录因子对TAs生物合成调控的分子机制。. 首先克隆并分析了颠茄TAs生物合成途径中PMT，TRI，CYP80F1和H6H这4个基因启动子，发现其具有较为丰富的W-box元件，意味着WRKY类转录因子可能调节TAs生物合成。在建立qPCR检测颠茄基因表达的标准技术体系基础上，发现TAs生物合成途径基因均具有须根特异/高表达特性，颠茄TAs基因这种协同表达特性表明调控TAs生物合成的转录因子可能也具有须根特异/高表达特性。从颠茄转录组中筛选出2个调节TAs生物合成的WRKY转录因子AbWRKY1和AbWRKY2，这两个WRKY转录因子均在须根中特异/高表达。AbWRKY1直接与AbH6H启动子结合并能够激活其表达，转基因结果表明过表达AbWRKY1能够提高AbH6H基因表达并促进东莨菪碱生物合成；过表达AbWRKY2能够促进颠茄转基因植株叶片中莨菪碱的积累，可能是其诱导了莨菪碱转运蛋白基因表达所致。因此，AbWRKY1是正调控东莨菪碱生物合成的转录因子而AbWRKY2是正调控莨菪碱生物合成的转录因子。. 次生代谢产物生物合成受到复杂调控网络的控制。钙离子作为第二信使能够促进TAs生物合成，钙调蛋白（Calmodulin，CaM）在钙离子信号转导中发挥及其重要的作用。AbCaM1具有须根高表达特性，能够结合钙离子。转基因结果表达AbCaM1能够上调AbWRKY1和TAs生物合成途径基因表达，最终导致莨菪碱和东莨菪碱合成能力提高。AbCaM1的鉴定，进一步深化了对WRKY调控TAs生物合成机制的解析。最后，培育的TAs高产颠茄发根和植株，具有良好应用前景

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