基于原位多糖特异性顺磁标记的全细胞固体核磁共振新方法

Polysaccharides are important bio-macromolecules. In-situ characterization on their structures and functions is one of the key research subjects in the field of chemical biology. Whole-cell solid-state NMR is capable of in-vivo detecting the dynamic structure of polysaccharides and observing the metabolic regulation on polysaccharides. In this project, we will develop a new method of whole-cell NMR based on paramagnetic labeling on polysaccharide. We will synthesize a series of phenylboronic derivative that containing Ln3+ chelating group. The paramagnetic labeling on polysaccharides on cell surface is achieved by the specific reaction of phenylboronic acid with cis-diol group of polysaccharide. The in-situ assignments on polysaccharides containing cis-diol structure could be obtained by the PRE effects by the Ln3+ ions. Taking E. coli as an example, we will take advantage of paramagnetic labeling with fast two-dimensional experimental techniques to perform the resonance assignments of the whole-cell solid-state NMR spectra and catalogue the polysaccharide signals according to the topological structure. On this basis, the interaction between antimicrobial polypeptide LAH4 and E. coli will be studied. The molecular mechanisms by which the LAH4 interacts with and cell wall interaction will be analyzed. The whole-cell solid-state NMR method established in this project will provide a new strategy for in situ study of the interaction and regulation of biological macromolecules.

多糖是重要的生物大分子，原位研究其结构与功能是目前的学术前沿。全细胞固体核磁共振技术，可以在活体细胞中，原位观测多糖的动态结构、代谢调控等，揭示多糖的生理活性，有重要的学术意义。在本项目中，我们将建立基于多糖特异性顺磁修饰的全细胞固体核磁共振新方法。我们将合成一系列含苯硼酸基团的稀土金属配位化合物，通过苯硼酸与顺式二羟基的特异性反应，实现细胞表面多糖的顺磁修饰，并利用顺磁弛豫增强效应指认含顺式二羟基结构多糖的原位信号。以大肠杆菌为例，结合顺磁修饰和快速二维实验技术，在原位条件下，指认大肠杆菌的全细胞固体核磁共振谱图，分析多糖信号的拓扑结构定位。在此基础上，研究抗菌肽LAH4与大肠杆菌的相互作用，分析LAH4与细胞壁互作的分子机理，以及其破坏大肠杆菌细胞壁的机制以及此过程的调控因素等。本项目建立的原位固体核磁共振方法，将为原位研究生物大分子互作与调控提供新的研究思路。

多糖是重要的生物大分子，原位研究其结构与功能是目前的学术前沿。全细胞固体核磁共振技术，可以在活体细胞中，原位观测多糖等生物大分子的动态结构、调控等，有重要的学术意义。在本项目中，我们建立了基于顺磁顺磁修饰的全细胞固体核磁共振新方法。通过合成含有苯硼酸基团的稀土金属配位化合物，利用苯硼酸与顺式二羟基的特异性反应，实现了细胞表面的顺磁修饰，并建立了指认多糖原位信号的核磁共振方法。此外，利用顺磁修饰的磷脂，建立了基于顺磁信号的抗菌肽蛋白在细胞膜拓扑定位的实验方法。基于这些实验方法，研究了抗菌肽与细胞膜的相互作用，分析了抗菌肽破坏病原菌的机理，如：关键磷脂组成和pH对与抗菌肽活性以及，攻击目标的选择等。依据相关机理，进行了新抗菌肽的设计，为下一步的应用奠定了基础。课题产生的新方法也被用于其他类型蛋白机理的表征。本项目建立的原位固体核磁共振方法，将为原位研究生物大分子互作与调控提供新的研究思路。在项目支持下发表学术论文情况（均标注了基金委支持）。部分研究成果已经在相关学术期刊发表，部分研究成果在整理待发表中。在项目资助下，已发表学术论文5篇，申请中国专利6项，其中3项已获授权。在人才培养方面，博士研究生毕业3名，硕士毕业1名，目前课题组在读博士生1名，硕士11名（含联合指导硕士研究生）。相关成果在多个国内、国际重要学术会议宣讲。

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