解析铝胁迫诱导饭豆根尖柠檬酸分泌的调控途径

铝毒是限制酸性土壤作物生长的主要因子之一。铝诱导植物根系分泌有机酸是多数植物最为重要的耐铝机制。虽然位于细胞质膜上的对有机酸具有通透性的通道蛋白是铝胁迫下有机酸分泌所必须的，但是越来越多证据表明这些通道蛋白的表达和功能受到一个复杂的信号通路的调控。本项目以铝诱导饭豆根系柠檬酸分泌为基础，以铝信号开始到柠檬酸分泌这个过程存在几个小时的时间滞后期为切入点，从基因组学，蛋白质组学，生理学等角度来研究这一过程中的变化因子；同时从饭豆根系中的柠檬酸转运蛋白本身入手研究基因和蛋白表达的调控以及对该基因上游序列的克隆分析；并通过对几个关键的因子作转基因验证。首次系统的开展了铝诱导植物根系有机酸分泌的调控途径的研究，可望对植物耐铝机制作出更新和更全面的阐述。本项目的开展不仅极大的丰富了植物耐铝的分子生理机制，而且为研究耐铝基因遗传进化，以及通过生物工程手段提高作物耐铝性提供科学依据。

饭豆是一种能在酸性铝毒土壤上良好生长的作物。生理学研究表明饭豆的耐铝机制是通过根尖柠檬酸的分泌从而将铝排斥于共质体之外。为解析饭豆铝胁迫下柠檬酸分泌的调控机制，本项目通过转录组分析和目的基因功能验证等对铝胁迫诱导饭豆根尖柠檬酸分泌的调控途径有了进一步的理解，主要研究结果概括如下：获得VuMATE1全长cDNA，将该基因异源表达于非洲爪蟾卵母细胞中证实该基因编码的蛋白质对柠檬酸具有通透性；将该基因转到番茄中发现转基因番茄具有分泌柠檬酸的功能；成果发表于Plant Cell Environment上（2011,34:2138-2148）。通过构建抑制差减杂交文库获得低铝（5 μM）诱导上调和高铝（25 μM）诱导上调基因107个和86个，获得低铝（5 μM）诱导下调和高铝（25 μM）诱导下调基因106个和101个；通过转录组比较分析，确定了一些可能与柠檬酸分泌有关的基因，主要为VuMATE1，VuMATE2，VuSTOP1；以上结果已被Plant Cell Environment录用。通过柠檬酸分泌时间响应发现铝诱导柠檬酸分泌分为两个阶段，VuMATE1负责后期分泌，而VuMATE2可能参与前期分泌；RT-PCR分析表明VuMATE2组成型表达于根尖，铝处理可诱导VuMATE2表达增强，将VuMATE2超表达于拟南芥发现转基因株系耐铝性增强，这部分工作仍在进一步完善中。蛋白翻译抑制剂预处理后VuMATE1表达被抑制，表明VuMATE1表达需要蛋白的重新合成；而在铝预处理后再用蛋白翻译抑制剂处理则发现宁柠檬酸分泌受到抑制，说明VuMATE1转录后调控也是柠檬酸分泌所必需的；蛋白激酶和蛋白磷酸酶抑制剂研究表明蛋白可逆磷酸化不仅是VuMATE1转录调控所必需，而且参与VuMATE1翻译后蛋白活性的调控；该成果发表于Journal of Experimental上（2013，64：1795-1804）。获得VuSTOP1全长cDNA，该蛋白具有保守的Cys2His2结构域，与水稻ART1和拟南芥STOP1同源；基因表达分析表明该基因组成型表达于根尖，铝处理后表达进一步增强；将该基因导入拟南芥stop1突变体发现，可部分回复stop1对铝的敏感性，却可极大的回复stop1对酸的敏感性；表明该基因主要功能为抗酸害而不是抗铝毒害，这部分工作仍在进一步完善中。

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