表观遗传修饰和DNA序列对于TALEN和CRISPR介导基因修饰的影响

Efficient and accurate genome engineering technologies are essential for the establishment of novel gene therapy approaches and animal models. Recent development of two types of site-specific nucleases, transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas) proteins (CRISPR/Cas), greatly expanded our capability of targeted gene modification. Because of the ease of design and application, both systems have been successfully applied to major model organisms and human cell lines.However, using either system, there are vast variations of the efficiency when different genomic loci are targeted and the underlying mechanism is poorly understood. Evolved in bacteria and archaea, CRISPR/Cas and TALEN systems have never been challenged by the complex genomic composition, the formation of chromatin, and the epigenetic modifications in mammalian genomes. Therefore, when introduced into mammalian cells, CRISPR/Cas system's activity and specificity could be significantly affected by these variables. Indeed, studies on a very limited number of genomic loci suggested that TALEN binding to DNA is sensitive to the presence of 5-methylated cytosine. Here, we propose to systematically characterize the efficiency of CRISPR/Cas and TALEN mediated genome editing across major epigenetic marks as well as the complex genomic sequence space, to provide an important reference for future applications and improvements of TALEN and CRISPR/Cas technologies.

高效精确的基因工程技术对于发展基因治疗，建立细胞和动物疾病模型具有极为重要的价值。近年来特异性定点核酸酶的研究取得了长足的进步。类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）和常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(CRISPR/Cas)具有精确高效，易于设计合成的优点，已经被广泛应用于多种模式生物及人类细胞系中。但其对不同基因位点基因修饰的效率具有很大差异，而我们对此差异产生的机制了解非常有限。这一局限导致我们在选择和设计目标位点时只能采用试错法，不仅影响效率，而且对一些难以修饰的位点没有好的解决办法。在本项目中，我们拟针对CRISPR和TALEN系统对不同位点基因修饰效率的差异，从遗传序列组成和表观遗传修饰两个方面进行系统的研究，从而阐明差异产生的根本机制。对这一差异产生机制的了解将使我们能够针对具体目标位点更有效的选择和设计基因修饰系统，从而提高基因工程的效率，促进新型基因治疗和动物模型的建立。

为揭示影响CRISPR系统基因编辑的重要因素，并基于此提高其基因编辑效率、拓展其技术应用，我们针对以下几个方面开展了系统的研究：1.我们研究了目标位点表观遗传修饰和DNA序列组成对于CRISPR系统效率的影响，找到了效率变化的重要相关因素，从而指导我们在 CRISPR 系统应用中更好地选择目标靶点；2. 我们研究了影响CRISPR系统sgRNA的稳定性和免疫原性的相关因素，我们通过尝试在sgRNA上面添加不同的化学修饰，提高了sgRNA在细胞内的稳定性，降低了其免疫原性，显著提高了在人类原代细胞中的基因编辑效率和细胞存活，成功建立了在CAR-T细胞中进行高效基因编辑的技术平台；3.通过在sgRNA骨架上添加特定蛋白结合序列，我们建立了Casilio技术，可以利用CRISPR系统将不同的效应蛋白招募到基因组目标位点，实现对于多个内源基因表达水平的调控和表观遗传状态的特异性修饰。4.建立了新型载体系统，在不使用任何细菌菌株的情况下，仅仅几个小时内生产出大量的 minicircle vector。与质粒相比，这种载体能够在细胞系、干细胞和原代T细胞中实现更高的转基因表达和更好的细胞活力。通过这一系列的研究和技术发展，我们可以在人类原代细胞如T细胞和造血干细胞中实现高效安全的基因编辑和基因表达调控，为细胞治疗在临床上面的应用提供了有力的技术基础。

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